تحقیق مقاله مطالعات ساختار شناسی رویسلول های بنیادی تخمدان در گاو

خلاصه . این مطالعه  و بررسی در مورد گاو ها در مراحل فاز فولیکولی و زرد تخمدان این دوره برای تعیین خواص رنگی ، پیدایش میکروسکوپی نور و الکترون و توزیع عددی سلول های بنیادی از مناطق گوناگون تخمدان بود . اطلاعات برای این بررسی شامل نمونه تخمدانی گرفته شده از 14 گاو ، 7 تا در مرحله زرد تخمدان و 7 تا در مرحله فازفولیکولی چرخه ی جنسی بود .

نمونه ها از سه منطقه متفاوت تخمدان از جمله اطراف کرپ زرد ، فولیکول گراف و مغز استخوان ، گرفته شدند . از گل سه منطقه ،سلول های بنیادیبعد از تصفیه بخش های قرار داده شده در پارافین باتلوئیدین بعنوان دگر رنگ شده و بواسطه سافرایین ترکیبی بعنوان (-) Ab(+)So  نشان داده شدند . در مطالعات میکروسکوپی الکترون ، مشاهده شد که یافته های شخا خواه دارای دو نوع گرانول ، یعنی گرانول های متراکم بطو همگن و گرانول های بسیار ریز ، می باشند .

مشاهده شد که سه ناحیه تخمدان در هر mm2 طی مرحله فازفولیکولی نسبت به طی مرحله زرد تخمدان ، دارای شمار متوسط سلول های بنیادی بالاتری است . در مرحله فازفولیکولی ، هر چند شمار سلول های بنیادی افزایش چشمگیری را پیرامون فولیکول گراف نشان می داد ، اما پیرامون کرپ زرد شمار پائینی از سلول های بنیادی نشان داده می شد . در مقایسه ، نشان داده شد که مغز استخوان نسبت به دو منطقه دیگر تخمدان دارای تراکم بسیار بالاتر سلول های بنیادی بود .

مقدمه :

یافته های شغا خواه ، بازوفیل ، پلاکت ها و سلول های درون پوشه ای منابع مشهور هیستامین در تخمدان می باشند . گزارش شده که هیستامین جریان خون و نفوذ پذیری رگی در بافت تخمدان را ، همراه با یک نقش در رشد فولیکولی و تخمک آوری تنظیم می کند .

در جوندگان سلول های بنیادی تنها در ناف تخمدان یافت می شوند نه در کرپ زرد ، بینابینی و یا فولیکول ها . در مقابل سلول های بنیادی در چند گونه دیگر از جمله انسان ها ، گاو ها و میمون ها ، در همه بخش های تخمدان یافت می شوند . در موش ها سلول های بنیادی در اکسترنای پوششی فولیکول گراف و کرپ زرد موجود نیستند ، در حالیکه گزارش شده شمار سلول های بنیادی در مغز استخوان با مرحله چرخه فازفولیکولی از حداکثر طی فازفولیکولی ، از طریق شمار متوسط در میان ورتاک ، به حداقل در پیش از ورتاک تغییر می کند . گایتان و دیگران حضور سلول های بنیادی را در کرپ زرد منقبض کننده در موش ها را گزارش کردند. بر خلاف این یافته در موش ها ، در گاو ها سلول های بنیادی در پوشش بیرونی کرپ زرد، اکسترنای پوششی فولیکول گراف و نیز در مغز استخوان مشاهده شده اند .

در بررسی تخمدان گاو ها ، گزارش شد که سرتاسر چرخه فازفولیکولی شمار سلول های بنیادی در مغز استخوان نسبت به پوسته مغز ، بالاتر بود . گزارش شد سلول های بنیادی در اکستر نای پوششی فولیکول غالب در همان بررسی، حتی متراکم تر بودند . در مرحله زرد تخمدان ، که کرپ زرد رشدش کامل می شود ، در شمار سلول های بنیادی افزایش چشمگیری مشاهده شد . در بررسی تخمدان انسان طی یائسگی و تخمدان های پرکیست ، در شمار سلول های بنیادیکاهش چشمگیری گزارش شد . مطالعات در مورد لوله های تخم بر گاو نشان دادند که شمار سلول های بنیادی در مراحل فازفولیکولی و زرد تخمدان در تنگراه نسبت به منطقه آمپولا بالاتر بود ، در حالیکه مرحله زرد تخمدان در هر دو منطقه نسبت به مرحله فازفولیکولی بالاتر بود .

در بررسی دیگری که روی رحم گاو انجام شد ، شمار سلول های بنیادی در مرحله فازفولیکولی گزارش شد که نسبت به مرحله زرد تخمدان بالاتر می باشد . همان محققان به افزایش در عدم رنگارنگی گرانول های سلول های بنیادی طی دوره ای با حد اکثر میزان استروژن توجه کردند .

این بررسی با هدف تعیین پیدایش و توزیع عددی سلول های بنیادی در مغز استخوان یا پوسته مغز تخمدان گاو طی مراحل فازفولیکولی و زرد تخمدان از طریق خواص رنگی آن ها و پیدایش آن ها در زیر میکروسکوپ های الکترونی نوری انجام شد.

مواد و روش ها

مواد تخمدانی از 14 گاو ، 7 تا در مرحله فازفولیکولی و 7 تا در مرحله زرد تخمدان چرخه ی جنسی ، از کشتارگاه آنکارا حاصل شد . دوره چرخه فازفولیکولی که هر حیوان در آن بود ، بواسطه بررسی میکروسکوپی تعیین می شد و میزان پروژسترون سرمی حیوانات بواسطه روش RIA تعیین می شد . مواد از مناطق پیرامون کرپ زرد ، فولیکول ها و مغز استخوان گرفته می شدند .

آزمایشات میکروسکوپی نوری

یک بخش از نمونه بافت به دست آمده در 10% فرمالین بعد از شستشو تثبیت می شد در حالیکه بخش دیگر در محلول اسید استیک فرمالدئید هم کشش برای 12 ساعت و با 70% الکل برای 12 ساعت دیگر تثبیت می شد و سپس بعد از عبور از الکل های مدرج ، استراسید بنزوئیک متیلو بنزین مسدود می شد . سپس بخش های متوالی 6nm جدا می شدند .

بخش های هریک از گروه ها یا با 5% تلوئیدین سبز رنگی می شوند یا با روش سافرانین / الکائین آبی ترکیبی به شرح زیردرست می کنند : از مجموعه بخش های  اشاره شده ، ده بخش که ضخامت هر یک 6nm است انتخاب می شوند ، مثلا بخش های 1 و 2 ( 5 بخش بعدی حذف می شوند ) ، بخش های 8و 9 ( 5 بخش بعدی حذف می شوند ) ، بخش های 15 و 16 ( پنج بخش بعدی حذف می شوند ) و بخش های 29 و 30 . 5 جفت بخش ، با فاصله  30nmبین هر جفت باقی می ماندند . یک بخش از بافت های تثبیت شده در 10% فرمالین و IFAA روی همان تکه گذاشته می شد و با استفاده از روش رنگ کننده سافرانین / الکائین آبی به شرح زیر رنگی می شود :

بخش ها را داخل آب فرو ببرید

در 5/0% الکائین آبی 8GX  و 30% اسید استیک برای 30 دقیقه رنگی کنید .

برای 5 دقیقه در آب بشوئید .

در 25% سافرانین و N 125/0 اسید هیدروکلریک برای 30 دقیقه رنگی کنید .

به سرعت آب زدایی کنید ، تصفیه کنید و در صمغ مصنوعی قرار دهید .

نمونه های بافت از روده های موش بعنوان کنترل برای سلول های بنیادی مخاطی استفاده می شدند در حالیکه بافت حاصل از پوست موش بعنوان کنترل برای سلول های بنیادی بافت پیوندی استفاده میشوند .

آزمایشات میکروسکوپی الکترونی

نمونه های بافت بدست آمده برای 24 ساعت در پارافرمالدئید – گلوتاراکدئید نگهداری می شد ، همانطور که توسط کارنوواسکی شرح داده شد . آن ها در تثبیت گرکاکودیلات برای 3 ساعت شسته می شدند و برای باردوم با 1% اسیدالسمیک تثبیت می شدند . سپس آن ها در استات اورانیل برای 2 ساعت رها می شدند و بعد از عبور از الکل های مدرج و اکسید پروپیلن در آرالدئیت M مسدود می شد . بخش های با ضخامت 300-400A بدست آمده از انسداد ها طبق روش مفروط بواسطه ونیبل و کوجشال مقایسه می شوند و با استفاده از میکروسکوپ الکترونی انتقال روش EM,95-2 زئیس کارل ارزیابی می شدند .

شمار سلول و تحلیل آماری

برای تعیین توزیع عددی سلول های بنیادی در تخمدان در نمونه های رنگی با تلوئیدین سبزه شمار سلول بدست آمده تحت 100 میکرومتر مربع چشمی استفاده می شدند . برای کمتر از بزرگنمایی 40x سلول های بنیادی در هر منطقه واحد شمرده می شدند . در هر بخش ، شمار یافته ها از 10 منطقه ، متفاوت انتخاب شده بطور تصادفی محاسبه می شدند برای بزرگنمایی 40x ، محدوده 100 میکرومتر مربع با روش لام میکرومتر تعیین می شد . بعدا ، تمام آمار عددی به شمار سلول های بنیادی در هر منطقه واحد تبدیل می شدند . تفاوت های بین مراحل فازفولیکولی و زرد تخمدان مورد بررسی بواسطه t-test  دانشجویان تعیین می شدند . spss برای این هدف بکار برده می شد .

نتایج

دریافت شد اکثر سلولهایی که با تلوئیدین سبز تحت آزمایش میکروسکوپی نوری خواص دگررنگی نشان می دهد ، مخصوصا در مغز استخوان و طی فازفولیکولی فراوان می باشند . در رنگ ترکیبی Ab/So ، سلول های بنیادی بعنوان Ab(+) ، So(-) تلقی می شدند . 

تصور می شود سلول های بنیادی اشکال و اندازه های متفاوتی از خود نشان می دهند . خاطر نشان شده که سلول های بنیادی در مرحله زرد تخمدان در شمار گرانول کاهش چشمگیری دارد . طی این دوره سلول های بنیادی خرد شده نیز مشاهده می شدند . با این وجود در دوره فازفولیکولی ، سلول های بنیادی بطور کامل با گرانول ها پر شدند . در مرحله فازفولیکولی ، هر چند شمار سلول های بنیادی افزایش چشمگیری را پیرامون فولیکول گراف نشان می داد ، اما در پیرامون کرپ زرد تعداد کمی سلول های بنیادی نشان داده می شد .

در آزمایشات میکروسکوپی الکترونی ، تصور می شد که سلول های بنیادی حاوی دو نوع گرانول می باشند ، گرانول های متراکم بطور همگن و گرانول های خیلی ریز .

شمار متوسط سلول های بنیادی در هر mm2 در پوسته تخمدانی (پیرامون فولیکول گراف و کرپ زرد ) و مغز استخوان

نشان داده می شوند . افزایش در شمار سلول های بنیادی طی مرحله فازفولیکولی در قایسه با مرحله زرد تخمدان از نظر آماری چشمگیر بود . در هر دو مرحله فازفولیکولی و زرد تخمدان ، شمار سلول های بنیادی پیرامون رگ های خون نسبت به مناطق دیگر بیشتر بود .