تحقیق مقاله چشم پوشیدن از اگزون القائی تحت فشار سرما در یک گونه از ژن انورتار سیب زمینی

چشم پوشیدن از اگزون القائی تحت فشار سرما در یک گونه از ژن انورتار سیب زمینی :

 دپارتمان سلول و ژنتیک مولکولی، نماد تحقیقات محصولات اسکاتلندی

 چکیده :

 ما نشان می دهیم که دو ژن انورتار در سیب زمینی مانند بیشتر دیگر، ژن های انورتار گیاهان، شامل یک اگزون بسیار کوتاه ثانویه با bp 9 است که سه آمینواسید مرکزی از یک طرح کاملاً حفظ شده در انورتارهای با اصل و مبداء متنوع، را کدگذاری می کند. این مبنی اگزون، یکی از کوچکترین اجزاء شناخته شده در گیاهان است و Pre – mRNA  حاصل از این ژن ها ممکن است نسبت به پیوند اتصال متفاوت، حساس و آسیب پذیر باشند چون یک شرط بالقوه برای تعامل ویژه با سیستم پیوند اتصال برای اطمینان از فرایند درست در جهت تولید یک mRNA کامل و بالغ وجود دارد. هیچ مدرکی دال بر پردازش بعد مشخص سازی انحرافی در طی نمود ژن انورتار عادی در سیب زمینی مشاهده نشد. صحت پردازش Post – tr – nscrptional  مربوط به pre – mRNA از یکی ژنها توسط فشار ناشی از سرما مشوش شده که منجر به حذف مین اگزون از برخی از گونه ها شده است. این رویداد پیوند اتصال متفاوت، تحت فشار سرما هم در برگ و هم در ساقه به وجود می آید ولی با ضربه یا آسیب القاء نمی شود این خود یک نمونه چشم نوشیدن اگزون و القای پردازش مختلف تحت فشار سرما بر شمار کوچک از گونه ها را اضافه می کند که برای نمایش اتصال پیوند متفاوت، در گیاهان نشان داده شده اند. حساسیت متنوع فرایند Post – tr – nscrptional   به فشار سرما برای دو گونه بررسی شد که به تشریح شرایط زنجیره هسته ای، برای اتصال صحیح آنها امکان خواهد داد.

 مقدمه :

 در گیاهان شکاف و تقسیم سوکوروز به گلوکز و فروکتوز می تواند با انولیتار یا سنتز سوکروز کاتالیز شود این آنزیم ها برای متابولیسم سوکروز مهم بوده و بنابراین در فرایندهای فیزیولوژیکی اساسی مشمول می باشند یعنی در هر دوی گیاهان کلی و سطوح سلولی نظیر تعامل فسج – حفره و تقسیم کربوهیدارت (4 . 3 ). انورتار می توانند به دو گروه خنثی (سیتومولیک) و اسیدی (واسولار و اسوپلاستیک) تقسیم شوند. انورتارهای اسیدی از انواع گسترده ای از گیاهان گرفته شده اند (برای تالیف مراجع به 7/6 مراجعه کنید) و با بسیاری کلون های ژنومی و CDNA هم ایزوله شده که در برخی گیاهان توسط خانواده یا گروهی از ژن های مرتبط کدگذاری می شوند (برای مثال 9/8 ) زنجیره آمینو اسیدی اشتقاقی آشکار می کند که پروتئین های انورتار گیاه، شماری از حالات کاملاً حفظ شده با یگویگو و با انورتارهای به دست آمده از مخمر و با باکتری را سهیم می کنند. اینها شامل یک حالت جایگاهی فعال بالقوه (WECPD) و یک حالن کاملاً مشخص (NDPNG/A) هستند که ممکن است در مکانیزم کاتالیزی شرکت کنند که نزدیک پایانه N پروتئین قرار دارد. این حالت دوم در پایگاه داده ای پروتئین به عنوان حالت مشخص B – Pruct . sihse (برای مثال PRO – Site ) مشمول شده است ویژگی کلون های ژنومی گیاه که از انوتارها را کدگذاری می کنند، به استثنای یک مورد خاص نشان داده که هسته مرکزی این طرح (DPN) با یک مینی اگزون bp 9 کدگذاری می شود. این یکی از کوچکترین اگزون های شناخته شده در گیاهان است. در سیستم های حیوانات یک ارتفاع یا طول اگزون کوچک با bp 51 برای ترفیع اتصال پیوند درست ارائه شده است. در مورد اگزون های کوچکتر که معتبر برای اتصال پیوند انحرافی (کج) هستند، از مجاورت مکان های اتصال پیوند ' 5 و ' 3 به وجود می آیند. در شمار خاصی از حیوانات و تعداد کمی از گیاهان، اگزون ها کوتاه تر از این حد هستند و پیشتر پیشنهاد شده که این اگزون های کوتاه تر ممکن است به مکان های اتصال پیوند نیاز داشته باشند که قویتر از حالات عادی و یا اضافی ای هستند که عناصر را برای شناخت صحیحشان قادر می کنند. انواعی از رویدادهای اتصال پیوند متفاوت (شامل حفظ اینترون، مکان های اتصال پیوند مختلف ' 5 و ' 3 ، چشم پوشی از اگزون و غیره ....) در سیستم های حیوانات کاتالوگ بندی شده است. چنین رویدادهائی برای منجر شدن به ترکیب پروتئین های مختلف نشان داده شده که ممکن است در عملکردشان با توزیع بافت متفاوت باشند. رویداد کاملاً هستند از اتصال پیوند متفاوت پیشنهاداتی را توسعه داده که یک مکانیزم متفاوت را پایه گذاری می کند طوری که در آن تنظیم نمود ژن می تواند تحت تاثیر قرار بگیرد. در گیاهان فقط نمونه های کمی از اتصال پیوند متفاوت توصیف شده است. چند مثال از رویدادهای پیوند ' 5  متفاوت شناخته شده برای مثال در گونه های برای rabisco activase در اسفناج و آرپیدوسپیس (14) و جو (15)، برای پروتئین محدود کننده RNAI در تابوکو (16) و برای سنتز Chorismate در گوجه فرنگی (17) پیوند متفاوت ' 3 در پردازش گونه های ژن P ذرت (18) و کدگذاری پروتئین Fla Vevia trinevia H روی می دهد فرایند متفاوت گونه برای سنتز نشاسته خره ای در برنج می تواند منجر به حفظ انتیرون 1 در حالت کامل و رسیده شود. با ارائه اندازه کوچک مینی اگزون در ژن های انورتار گیاه، گونه های آنها موارد کاندیدی برای پیوند مختلف هستند که منجر به حذف زنجیره رمزگذاری شده توسط مینی اگزون از mRNA کامل و تبدیل به یک پلی پپتید جهش یافته می شوند که فاقد هسته B – Pruct . sihse است. این احتمال باعث شده که بروز نموده از ژن های انورتار در سیب زمینی برای رویدادهای پیوند متفاوت را بررسی کنیم. ما شرح می دهیم که پیوند مختلف می تواند با فشار تحت سرما القاء شود و اینکه یک اثر متفاوت در طی نمود دو ژن انورتار گیاهی بررسی شده است.

 PCR ژنومیک :

 DNA از برگ Sola nam tobersam و با فرایند اشتقاق شامل یک مرحله الکلی SDS Lysis ایزوله می شد. آلیکوت های ng 30 به عنوان نمونه در یک سنجش PCR با حجم کلی  50 شامل  1 از هر یک از ' 5 و ' 3 بر پیمرها استفاده می شدند. (برای  Amw6 , AmwT1 , CD111 ، برای Amw2 m , AmwT4 , CD141 ) ( mh 2/0 از mm , dNTP 5/1 کلرید منزیم، mm 50 کلرید پتاسیم و nm 20 Tro – Hcl یا PH 4/8 و uTaq1 پلی مری ) PCR برای حدود 40 چرخه (c 95 در یک دقیقه، 65 درجه یک دقیقه و 65 درجه و یک دقیقه و c 72 در سه دقیقه به ازای هر چرخه) با یک امتداد نهائی 72 درجه ای به مدت 5 دقیقه انجام شد. محصولات واکنش یا عزل آگاروز الکتروفورسیس و تحلیل شده و محصولات خاص به دست آمده در PGEm – T (پرومگا) کلونی شده و در هر دو جهت متوالی می شوند.

 PT – PCR :

 RNA کلی از برگ و ساقه Solamum tubersum  به دنبال روش اسکرو درات آال ایزوله شده. DNA آلوده با کشت uRQ1 DNase (مجزا از RNase ) در mm 10  10 تریس کلرید هیدروژن وب هاش 8 ، mMEDTA 1 شامل URNase 72 عامل مانع برای مدت 20 دقیقه در 37 درجه سانتی گراد به دنبال رسوب RNA و تکرار این عمل خارج می شود (جدا می شود). آلیکوت های 2 از RNA کلی (مجزا از DNA ) با u 200 ترانس کرپتیاس تضاد اندیس بالا، در یک حجم نهائی از  25 کلرید پتاسیم mm 75 ، mm 3 کلرید منیزیم، mm 10 از DTT و mm 50 و کلرید هیدروژن Pris با PHA در 42 درجه سانتی گراد به مدت 45 دقیقه و در حضور mm 1 dNTP و  5/0 از پریمر 3 متناسب (برای CD111 , 111R ، برای CD141 , 141R ) به صورت متضاد رونوشت می شود.

 نمونه هائی از  از این واکنش برای فراهم کردن نمونه و الگوی CDNA برای PCR به کار می رفت که از همان پریمر ' 3 با پریمر مناسب ' 5 [ برای CD111 ، نوع 111F ، برای CD141  نوع 141F ] استفاده می شد و با P 32 پایان یافته و به صورت توصیف بالا به کار می رفت. شرایط PCR ، 35 چرخه 94 درجه سانتی گراد در مدت 1 دقیقه، 60درجه در 2 دقیقه و 72 درجه در 3 دقیقه بوده که با یک مقدار نمائی در 72 درجه برای مدت 5 دقیقه دنبال می شد. محصولات RT – PCR با فرایند الکترو فروسیس در 6 درصد پلی اکرپلآمید و 10 درصد ژل های فورمامید برطرف شده و با رادیوگرافی خودکار بررسی می شوند. محصولات به دست آمده با استفاده از پریمرهای CD111 از ژل پلی اکریل آمید الوت شده و به عنوان لایه فرعی برای آزمایشات PCR با استفاده از این پریمرها و با شرایطی مانند شرایط اعمالی برای PCR ژنومی استفاده می شد، به استثنای اینکه یک دمای منسجم 60 درجه ای و 35 دایره (چرخه) در آن و بکار می رفت. محصولات خاص از این واکنش به صورت PGEM – T کلونی شده و در هر دو مسیر متوالی می شوند.

 شرایط فشار :

 آزمایشات فشار بر روی گیاهچه ها در کشت بافتی رشد یافته بر حالت متوسط 30 – ms تحت یک چرخه 8/16 ساعته روز به شب در دمای 25 درجه سانتیگرادی انجام شدند. سه هفته بعد از کشت نوعی بندهای آپیکال، گیاهچه ها تحت فشار سرما یا ضربه قرار گرفتند. در مورد فشار سرما این گیاهچه ها به یک بخش رشد انتقال یافته و در 4 درجه سانتی گراد نگه داری می شدند. البته با شرایط دیگر مشابه با مواردی که قبلاً توصیف شده گیاهچه ها بعد از 0 (کنترل) ، 6 ، 24 و 48 ساعته برداشت می شوند (کشت) برای بهبود (بازیافت) بعد از 48 ساعت در دمای 4 درجه، گیاهچه ها به دمای 25 درجه به مدت 24 ساعت، قبل از کشت منتقل می شوند برای فشارهای ناشی از ضربه برگ های گیاهان با یک چاقوی تیزاستریل شده بر روی تمام سطح خراش داده می شوند و بعد از 48 ساعت کشت می شوند.

 نتایج :

 سازمان دهی ژن های انوتار در گیاهان :

 امروزه کلونی های ژنومی که از هویج، آرابی و پسیس ها، ذرت و گوجه فرنگی جدا شده اند سازمان دهی اینترون آنزیم های انورتار را کدگذاری می کنند، و اگزون تمام اینها با حضور یک اگزون اصل تقریباً kb 1 مشخص می شود که بیشتر پلی پپتیدها را کدگذاری می کنند از جمله مکان فعال ارائه شده، جریان پایین روی این نوع تغییر در اندازه اینترون ها با فقدان آنها در برخی موارد آشکار است (برای مثال یک ژن آربید وپسیس که در آن اگزون اصلی با دو اگزون بیشتر، در ژن های دیگر، نشان داده می شود.)

 جریان بالا روی اگزون اصلی یک ویژگی عجیب از این ژن ها، حضور یک اگزون بسیار کوچک فقط در اندازه bp 9 است که در نظام ژن های به استثنای یک ژن در هویج وجود دارد. هر دوی اینترون ها که در کنار مینی اگزون هستند، نشان می دهند که تنوع ارتفاع در این گونه های گیاهی وجود دارد. اگزون bp 9 ، سه آمینواسید با حالت (DPN) B – Fractosidase را کدگذاری می کند که برای شرکت در شکل گیری محل کاتالیزی آنزیم یعنی عملکردی مطابق با درجه بالای آن در حفظ دگرگونی، پیشنهاد کرده است.