تحقیق مقاله ساخت محلول ها

- محلولهای بافری:

محلول بافر A :

این محلول ، بافر تریس بازی با غلظت mM 50 ،‌8/5=PH می باشد که از محلول استوک آن ،‌با غلظت mM200 به طریقه زیر تهیه شد:

مقدار g22/24 تریس بازی وزن شد و با ml800 آب مقطر در یک بشر یک لیتری مخلوط شد. PH این محلول با استفاده از محلول Hcl ،‌37% تا 8/5= pH پائین آورده شد. سپس حجم نهایی توسط آب مقطر به یک لیتر رسانده شد. محلول استوک بدست آمده ، 4 بار رقیق شد تا محلول بافر A حاصل شد.

2-1- محلول بافر B:

این محلول ، بافر تریس بازی با غلظت mM50 ،‌8/6PH= می باشد که همانند محلول بافر A تهیه شد با این تفاوت که کاهش pH محلول تا 8/6=pH  صورت گرفت.

3-1- محلول بافر C:

این محلول ، بافر فسفات سدیم با غلظت mM10،8/6= pH است که از محلول استوک آن با غلظت mM 100به طریقه زیر تهیه گردید:

مقدار g81/35 نمک فسفات دی سدیک و g6/15 نمک فسفات مونوسدیک به همراه ml800 آب مقطر در یک بشر یک لیتری مخلوط شد. سپس pH محلول توسط محلول Hcl، 37% تا 8/6= pH پائین آورده شد و با آب مقطر حجم نهایی محلول به یک لیتر رسانده شد. محلول استوک بدست آمده ، 10 بار رقیق شد تا محلول بافر c بدست آمد.

2- محلول های الکتروفورز:

1-2- محلول بافر تانک یا الکترود:

این محلول شامل تریس بازی با غلظت M025/0 و گلایسین با غلظت M192/0 ، با 3/8= pH در آزمایشات الکتروفورز بکار گرفته شد. این محلول به حجم یک لیتر به صورت زیر تهیه شد:

مقدار g03/3 تریس بازی و g4/14 گلایسین وزن شده و در یک بشر یک لیتری تا حجم یک لیتر ، آب مقطر به آنها اضافه گردید.

2-2-محلول بافر ژل متراکم کننده (ژل فوقانی):

این محلول با غلظت M5/0 تریس بازی ، 8/6 = pH به طریقه زیر تهیه شد:

مقدار g 1/6 تریس بازی به همراه ml70 آب مقطر در یک بشر مخلوط شد و با کمک محلول Hcl37%، pH  آن تا 8/6 کاسته گردید. سپس حجم نهایی محلول با آب مقطر به ml100 رسانده شد.

3-2- محلول بافر ژل جدا کننده (ژل تحتانی):

این محلول با غلظت M5/1 تریس بازی ، 8/8 = pH به طریقه زیر تهیه شد:

مقدار g 2/18 تریس بازی در ml70آب مقطر به حالت محلول درآورده شد و توسط محلول Hcl37% pH آن تا  8/8 کاهش پیدا کرد. سپس حجم نهایی محلول با آب مقطر به  ml 100 رسانده شد.

4-2- محلول بافر نمونه (× 5):

حجم ml15 محلول بافر تریس بازی با غلظت 1M، 8/6= pH (g81/1 تریس بازی در ml15 آب مقطر) تهیه شد. به این محلول ml25گلیسرول ، و ml10 آب مقطر افزوده گردید و بخوبی مخلوط شد. به محلول حاصل چند بلور رنگ برموفنل بلو اضافه شد تا محلول به رنگ آبی تیره درآمد.

5-2- محلول آکریل آمید – بیس آکریل آمید:

پودر آکریل آمید و بیس آکریل آمید سمی بوده و باید از استنشاق آنها جلوگیری کرد. جهت تهیه محلول استوک 8/30% از آن با استفاده از دستکش و ماسک ، در زیر هود شیمیایی ،‌مقدار g30 پودر آکریل آمید و g8/0 پودر بیس آکریل آمید وزن شد و در یک بشر تا حجم ml100 آب مقطر مخلوط گردید. برای حل شدن بهتر مواد فوق در آب مقطر ، بشر در حمام آب گرم قرار داده شد و به کمک همزن مغناطیسی به مدت 30 دقیقه مخلوط شد. سپس محلول بدست آمده توسط کاغذ صافی فیلتر شد و در ظرف تیره رنگی در یخچال نگهداری گردید. محلول فوق خطرناک و نورو توکسیک می باشد و در طی کار آبا آن باید از دستکش استفاده کرد.

6-2- محلول آمونیوم پرسولفات (APS):

جهت تهی محلول 10 درصد APS، مقدار g1/0 پودر آمونیوم پرسولفات وزن شده و در 1ml آب مقطر حل گردید. این محلول بهتر است تازه تهیه شده و در یخچال نگهداری شود.

3- محلولهای رنگامیزی ژل پلی آکریل آمید:

1-3- محلول رنگامیزی کوماسی بلو G-250:

حجم ml50 محلول رنگامیزی با مخلوط کردن اجزاء زیر تهیه گردید:

ml15 متانل و ml10 اسید استیک گلاسیال با ml25آب مقطر مخلوط شد. به محلول حاصل مقدار g2/0-1/0 رنگ کوماسی بلو G-250 اضافه گردید تا محلول آبی تیره رنگی بدست آمد. این محلول بعنوان محلول ثبوت پروتئینها نیز عمل می کند.

1-1-3- محلول رنگبر:

برای زدودن رنگ از ژل ، به حجم بیشتری محلول رنگبر نسبت به محلول رنگامیزی نیاز است . حجم ml100از این محلول برای رنگبری یک ژل کوچک با ضخامت mm75/0 کافی می باشد. برای تهیه آن ml30 متانل و ml20 اسید استیک با ml50 آب مقطر مخلوط شد و در ظرف درب بسته ای نگهداری گردید.

2-3- محلولهای رنگامیزی نقره :

این محلولها شامل چهارمحلول ، به ترتیب جهت رنگامیزی بکار برده شدند. هر یک از محلولهای رنگامیزی به حجم ml60 تهیه شد که جهت رنگامیزی یک ژل کوچک با ضخامت mm75/0 کافی می باشد. تمامی محلولها برای هر بار رنگامیزی ، تازه تهیه شده و پس از استفاده دور ریخته شدند.

1-2-3- معرف ثبوت:

حجم ml60 محلول استوک استن 50% (V/V) (ml30 استن در ml30 آب مقطر) با حجم ml5/1 محلول استوک تری کلرواستیک اسید (TCA) 50% (V/V) (ml 75/0TCA در ml75/0 آب مقطر ) مخلوط شد. سپس 25 میکرولیتر محلول فرمالدتید 37% اضافه شد.

2-2-3- محلول پیش تیمار II :

حجم 100 میکرولیتر محلول استوک تیوسولفات سدیم 10% (W/V) (g 1/0 تیوسولفات سدیم خشک در 1ml  آب مقطر ) با ml60 آب مقطر مخلوط گشت.

3-2-3- معرف رنگ:

حجم ml8/0 محلول استوک نیترات نقره 20% (W/V)  (g2/0نیترات نقره خشک در ml1 آب مقطره ) و حجم ml6/0 محلول فرمالدئید 37% به ml60 آب مقطر اضافه شده و مخلوط گردید.

4-2-3- معرف ظهور

مقدار g2/1 کربنات سدیم وزن شده و در ml60 آب مقطر حل شد. سپس 25 میکرولیتر محلول فرمالائید 37% و 25 میکرولیتر محلول استوک تیوسولفات سدیم 10% (W/V)  (g1/0 تیوسولفات سدیم خشک در ml1 آب مقطر) به محلول فوق اضافه و مخلوط گشت.

4- معرف برادفورد:

جهت تهیه این معرف که به منظور سنجش مقدار پروتئین محلول بکار برده شد، به طریقه زیر عمل گردید:

مقدار mg100 رنگ کوماسی بلو G-250 وزن شده و در ml50 اتانل 95%  حل شد. به محلول حاصل ، ml100 ارتوفسفریک اسید 85% اضافه گردید. سپس حجم نهایی محلول با افزودن آب مقطر به یک لیتر رسانده شد. محلول بدست آمده با استفاده از کاغذ صافی فیلتر شده و در ظرف درب داری نگهداری شد.

آماده سازیها:

آماده سازی ژل سفادکس G-50:

مقدار g20 ژل سفادکس G-50 خشک وزن شده و در یک ارلن نیم لیتری با ml300 محلول بافر Bمخلوط شد. سپس این مخلوط به مدت 5 ساعت در حمام آب گرم) (90°c قرار داده شد تا ذرات ژل کاملاً متورم شدند. در این مرحله ، ژل گرم ، در دو نوبت 5 دقیقه ای ، به کمک دستگاه پمپ خلاء ،‌دگازشد تا تمامی حبابهای هوا از داخل ژل خارج گردید.

آماده سازی ژل سفادکس G-200:

مقدار g10 ژل سفادکس G-200  به همراه ml200 محلول بافر C  در یک ارلن نیم لیتری با ml 300محلول بافر B مخلوط شد. و همانند روش قبل به مدت 5 ساعت در حمام آب گرم) (90°c  قرار داده شد سپس ژل گرم در سه نوبت 5 دقیقه ای ، توسط دستگاه پمپ خلاء ، دگاز شد تا تمامی حبابهای هوای موجود در ژل تخلیه گردید.

آماده سازی ژل تعویض یون DE52:

این ژل بصورت مرطوب موجود بوده و جهت آماده سازی نیازی به حرارت ندارد. متناسب با حجم ستون مورد نظر ،‌مقداری از ژل مرطوب DE52  در یک بشر با گنجایش ml250ریخته شد و با ml200 بافر B مخلوط گردید. سپس ظرف حاوی ژل به مدت یک شبانه روز ، با یک بار تعویض بافر ،‌در دمای اتاق قرار داده شد تا ژل با محلول بافر به تعادل رسید.

آماده سازی کیسه دیالیز:

کیسه دیالیز خشک با انجام مراحل زیر برای مصرف آماده شد:

کیسه دیالیز در ml200 محلول کربنات سدیم 5% (W/V)  g)5 کربنات سدیم در ml100آب مقطر ) دو مرتبه و هر بار به مدت 15 دقیقه جوشانده شد. سپس کیسه کاملاً با آب مقطر شستشو داده شد تا از کربنات سدیم پاک شد. در مرحله بعد کیسه در ml200محلول EDTA با غلظت mM5 g)37/0 در ml200آب مقطر) به مدت 15 دقیقه جوشانده شد. سپس داخل و خارج کیسه با آب مقطر شستشو داده شد. کیسه دیالیز آماده شده در محلول اتانل 70% به مدت طولانی نگهداری شد.

محلولهای سوبسترا:

1-5- محلول متیل کتکول:

این محلول با غلظت M5-10×5 به طریقه زیر تهیه شد:

مقدار mg2 از رنگ متیل کتکول با ترازوی حساس وزن شد و به یک بشر کوچک منتقل گردید . حجم ml4 الکل ایزوپروپانل به ماده فوق اضافه شد و به خوبی مخلوط گشت . این محلول به آرامی تا دمای جوش محلول حرارت داده شد و به محض رسیدن به این دما حرارت قطع گردید. پس از اطمینان از اینکه ماده ‌فوق کاملاً در الکل حل شده است ،‌با استفاده از ایزوپروپانل حجم نهایی محلول به ml5 رسانده شد. این محلول در تاریکی بمدت یک هفته قابل نگهداری می باشد.

2-5- محلول متیل فنل:

این محلول با غلظت 5-10×5 مشابه طریقه فوق تهیه شد:

مقدار mg2 از رنگ متیل فنل در یک بشر کوچک با ml4 ایزوپروپانل مخلوط شده و تا رسیدن به دمای جوش محلول حرارت داده شد. سپس با افزودن ایزوپروپانل ،‌حجم نهایی محلول به ml5 رسانده شد.

روشها:

تهیه عصاره از قارچ:

1-1- هموژنیزاسیون :

اولین مرحله در فرایند تخلیص پروتئینها ، مطابق (شکل 1 ) هموژنیزاسیون بافت مورد نظر ،‌ جهت تهیه عصاره می باشد. تهیه عصاره از یک منبع طبیعی همچون قارچ خوراکی با روشهای مختلفی قابل انجام است . همانگونه که در شکل (پیوست) نشان داده شده است . خرد کردن سلولها به دو روش عمده صورت می گیرد:

روش مکانیکی 2- روش غیر مکانیکی

در روش مکانیکی ، عمل خرد نمودن سلولها در دو حالت مایع و یا جامد انجام میشود. در روش مایع . استخراج پروتئینها از بافت مورد نظر در محیط مایعی همچون محلول بافر صورت می گیرد. بدین منظور بافت به همراه بافر در مخزن دستگاه هموژنایزر ریخته شده و با ایجاد نیروی مکانیکی در مخزن، سلولها خرد می شوند و به همراه محلول بافر مخلوط همگنی را تشکیل می دهند. بدین ترتیب محتویات داخل سلولها از جمله پروتئینها ، به داخل بافر آزاد می گردند.

از آنجائیکه پروتئینها ،‌مولکولهای کم و بیش محلول در آب هستند، بخشهای نامحلول و قطعات خرد نشده و سخت سلولی را می توان با کمک ته نشین سازی با روش سانتریفوگاسیون ، از بخش محلول جدا نمود. (2)

2-1- ممانعت از فعالیت پروتئازهای سلولی با استفاده از محلول PMSF:

یکی از مسائل مهم در فرآیند تخلیص پروتئینها از بافتهای زنده ، حفظ پایداری پروتئین هدف است و مهمترین عاملی که بر ساختار پروتئینهای موجود در عصاره ، آسیب وارد می کند. شکست پروتئولیتیک توسط پروتئازهای سلولی می باشد. پروتئازها دسته ای از آنزیمها هستند که فعالیت پروتئازی خود را بر روی سایر آنزیمها و پروتئینها انجام می دهند. از این رو در مرحله تهیه عصاره ،‌لازم است تا با استفاده از یک ترکیب ممانعت کننده فعالیت پروتئازها ،‌همچون PMSF از این خطر جلوگیری بعمل آید. PMSF مهار کننده تمامی سرین پروتئاز ها است و با غلظت مؤثر mM1-1/0 و نیمه عمر یک ساعت ، قادر است  سرین پروتئازها را بطور برگشت ناپذیر و سیستئین پروتئازها را با احیای گروه تیول آنها . بطور برگشت پذیر مهار نماید. (8)

3-1- سانتریفوگاسیون :

یکی از روشهای متداول مورد استفاده در آزمایشات استخراج و تلخیص پروتئینها ، روش سانتریفوگاسیون می باشد. این روش بطور کلی به منظور اهداف زیر بکار می رود:

1- بازیافت رسوبها

2- جداسازی دو فاز مایع غیر قابل اختلاط

3- بخش بندی اجزاء سلولی همچون اسیدهای نوکلئیک و پروتئینها

در این روش ، ذرات مختلف موجود در محلول ، تحت تأثیر نیروی میدان سانتریفوگال ، با سرعتهای متفاوتی ته نشین می شوند بطوریکه سرعت ته نشین سازی وابسته به عواملی چون : اندازه ، شکل ، بار ،‌چگالی ذره در مقایسه با محیط سانتریفوگاسیون ، ناروانی محیط و دما است (7)

در مرحله جداسازی مقدماتی فرایند تخلیص ، صاف کردن هموژن سلولی در مقادیر آزمایشگاهی و بازیافت رسوب محولها با استفاده از دستگاههای سانتریفوژ یخچالدار با دورهای متوسط تا بالا صورت می گیرد. سانتریفوژهای با دور بالا می توانند سرعتهای rpm75000-2000 یا  g× 500000-g×40000 را تأمین نمایند.(2)