پلی هیدروکسی آلکانوئات های با طول متوسط (Medium chain leught pcgy (3hA) گروه بزرگی از پلی استرهای طبیعی هستند که توسط باکتری ها تولید می شوند و تنوع ساختاری بالقوه و بالفعل بالای این پلیمرها باعث افزایش توجه نسبت به تولید اقتصادی آن ها شده است . کنترل مونورهای تشکیل دهنده و استراتژی های مختلف تخمیر که امکان طراحی و ساخت پلیمرهای با ساختار ویژه را فراهم می سازد . علاوه بر آن پلی (3HA) های فعال شده برای تغییرات شیمیایی بیشتر نیز تولید شده اند .
تولید MCLPHA در طبیعت به اعضای از جنس Pseudemenas که متعلق به همولوژی rRNA نوع I هستند محدود می شود . درمیان این جنس گونه های P .flueresceus , .aeruginesa P ، P.oleovorans ،P.lemonnieri ، P . testeroni ، P . puteda ، قرار دارند .
MCL –poly3HA تنها یک نوع پلیمر نیست بلکه خانواده های بزرگی از انواع پلی استرها است که ترکیب و ویژگی های آن با توجه به ترکیب مونورهای در دسترس متفاوت است تاکنون بیش از 100 نوع MCL – poly3HA شناسایی شده اند که دارای مونورهای بین 6 تا 16 کربن و زنجیره های متنوع اشباع ، غیر اشباع ، بدون شاخه ، دارای شاخه‌ی آلیفاتیک ، یا آروماتیک هستند . علاوه بر این ها مونومرهای با انواع گروههای جانبی فعال نظیر اتم های هالوژن ، هیدروکسی ، اپوکسی ، سیانو ، کربوکسیل ، فنوکسیل ، سیانوفنوکسی ، نیتروفنوکسی و همچنین کربوکسیل استری شده قابل پلیمریزه شدن به MCL –poly3HA هستند . تمامی پیوندها به علت خاصیت فضا ویژگی آنزیم های پلیمر از به صورت R می باشند . وزن مولکولی پلیمرها بسته به نوع میکروارگانیسم ، نوع پلیمر و شرایط رشد بین 105 ×2 تا 106 ×3 است .
نقش زیستی
MCL –poly3HA ها به عنوان منابع ذخیره‌ی کربن ، انرژی در باکتری ها عمل می کنند و هنگامی که کربن مازاد بر نیاز در محیط موجود است تولید می شوند . از آنجا که این ترکیبات به صورت پلیمر ذخیره می شوند بنابراین تغییر محسوسی در فشار اسمزی سلول نمی دهند . هنگامی که منبع کربن خارج سلولی کاهش یابد این پلیمرها توسط آنزیم های دپلیمراز درون سلولی تجزیه شده و مورد استفاده قرار می گیرند . تبدیل منابع غذایی اضافه به مواد ذخیره ای دارای ارزش بقا است چون دسترسی میکروارگانیسم های رقیب را به آنها کاهش می دهد .
کارکرد احتمالی دیگری که MCL –poly3HA میتواند داشته باشد در سم زدایی است . ترکیباتی مثل آلکان ها ، آلکانول ها و اسیدهای چرب در غلظت های پایین برای میکروارگانیسم ها سمی محسوب می شوند و حذف سریع آنها از طریق تبدیلشان MCL –poly3HAزیستایی میکروارگانیسم ها را افزایش می دهد .
MCL در مقابل SCL
در طبیعت انواع مختلف poly3HA دیده می شود و هر ناظری کارکردهای متنوع را برای آنها انتظار دارد . هنگامی که منبع غذایی باکتری ترکیبات آلیفاتیک باشند MCL –poly3HA ها فرم مناسبی برای ذخیره سازی هستند . در مقابل SCL – Pcly (3HA) ها در حضور کربوهیدرات بهتر و بهینه تر به نظر می رسند . اگر فرض کنیم که مونورهای poly3HA پس از دپلیمریزه شدن توسط ATP فعال می شوند . دراین صورت به عنوان مثال تبدیل کانوئیک اسید به MCL –poly3HA و سپس تبدیل آن به استیل کوآ نسبت به تبدیل مستقیم آن به استیل کوآ تنها مصرف یک ATP اضافی را می طلبد . در صورتی که اگر پلیمر SCL – poly3HA {poly3HA} باشد 5/2 مولکول ATP باید مصرف شود ( شکل - ) . درکنار صرفه جویی در انرژی توانایی MCL –poly3HA در حفظ قدرت احیا (Reducing power) ی مولکول نیز بیشتر است . تبدیل کانوئیک اسید به 3- هیدروکسی کانوئیک اسید تنها منجر به تولید یک FADH می شود و باقی قدرت احیا در مولکول محفوظ می ماند . در مقابل تبدیل آن به 3- هیدورکسی – بوتیریک اسید معادل NADH 5/1 و FADH 4 تولید می کند و قدرت احیای کمتری را در مولکول باقی می گذارد .
در مقابل SCL –poly3HA ها در صورت استفاده از کربو هیدرات ها منابع ذخیره ی بهتری هستند . این امر بدین خاطر است که تولید MCL –poly3HA از طریق سنتز اسید چرب نیازمند مصرف ATP و قدرت احیای بیشتری است با تجزیه ی آن توسط مسیر بتا – اکسید اسیون .
بنابراین به طور خلاصه در صورت استفاده از سوبستراهای آلیفاتیک MCL –poly3HA یک ترکیب ذخیره ای مناسب و در صورت استفاده از سوبسترا های کربوهیدراتی SCL –poly3HA یک ترکیب ذخیره ای مناسب است .
بیوسنتز و متابولیسم :
همانطور که پیشتر اشاره شد ، نوع مونومرهای تشکیل دهنده ی MCL –poly3HA بستگی به نوع منبع کربن حاضر در محیط دارد . مثلا در P.olecvorans بسته به نوع –n آلکانی که به باکتری داده شود نوع پلیمر محصول متفاوت است . در طی این آزمایشها دیده شده که این آلکان طی از دست دادن گروههای دو کربنه تجزینه شده اند . بنابراین احتمال اینکه مسیر بتا – اکسید اسیون در سنتز MCL –poly3HA دخیل باشد . مطرح شده این نوع نتایج بعدا تائید شده و ژن های مربوط شناسایی شدند . مسیر معمول سنتز MCL –poly3HA از طریق بتا – اکسیداسیون در شکل – آمده است شکل مقابل بتا- اکسیداسیون مسیر بیوسنتز اسیدهای چرب MCL –poly3HA بدین طریق نیز تولید میشود :
نتایج آزمایشها با طبیعت این مسیرها سازگار هستند . به عنوان مثال رد p.putede kt2442 سه نوع مسیر متفاوت برای تبدیل هگزانوئیک اسید به MCL –poly3HA قابل مشاهده است هگزانوئیک اسید می تواند مستقیما پس طی یک نیم چرخه از بتا – اکسیداسیون تبدیل به 3- هیدروکسی – هگزانوئیک اسید شده و در ساختار PHA شرکت کند . یا آنکه در چرخه ی بتا- اکسیداسیون تماما به استیل کوآ تبدیل شده و استیل کوآ برای بیوسنتز مونومرهای مختلف C 6 تا C14 بکار گرفته شود. از طرف دیگر وجود مونومرهای غیر اشباع حاکی از آن است که سنتز Denevo ی اسیدهای چرب صورت می پذیرد . همچنین مدارکی مبنی بر طویل شدن خود هگزانوئیک اسید وجود دارد .
از طرف دیگر ترکیباتی بی ارتباط چون گلوکز ، فروکتوز و گلیسرول هم میتوانند به MCL –poly3HA تبدیل شوند . این نوع پلیمرها تنها مونومرهای C8 و C10 دارند . علاوه بر این حضور وابسته به دمای اسیدهای چرب غیر اشباع و قطع تولید MCL –poly3HA در حضور سرولنین (Cerulenin) ( یک مهار کننده ی سنتز اسیدهای چرب ) تبدیل این ترکیبات از طریق بیوسنتز اسیدهای چرب ( مسیر دوم ) را تائید می کند .
طراحی فرآیند در دو گونه ی pseudemenas
طراحی فرایند در تولید MCL –poly3HA بیشتر روی بهینه سازی فاکتورهای چون yield , producfivity و درصد poly3HA در بیومس توجه داشته است . تولید MCL –poly3HA در مقیاس پایلوت در مورد p.putida و p. oleovoraw به خوبی مطالعه شده است . این دو گونه تفاوت بسیار زیادی را در شرای تولید نسبت به یکدیگر نشان می دهند .
p.oleovoran به علت حضور پلازمید OCI 1 می تواند از آلکان ها و آلکن ها به عنوان سوبستر استفاده کند . P.putidan قادر به این کار نیست ولی در مقابل می تواند کربوهیدرات را برای تولید MCL –poly3HA مصرف کند . p . putida قادر است MCL –poly3HA را در فاز رشد نمایی ( هنگامی که منابع به فراوانی در دسترس هستند ) تولید کند ، در حالی که p. oleovoran تنها در صورتیکه کمبود یکی از منابع رشد را محدود کرده باشد دست به تولید MCL –poly3HA می زند .
p. olevoran
استفاده از p. oleovoram برای تولید MCL –poly3HA در شرایط fed- batch و پیوسته ( continuom) صورت گرفته است . محیط های رشد دو فازی شامل یک فاز آبی محتوی باکتری و یک فاز آلی اکتان بوده اند . وجود فاز الی در فرمانتوراین امکان را فراهم می سازد که بدون وارد کردن مرتب ترکیبات کربنی ، منبع کربن باکتری همواره تامین باشد . پس ازیک فاز batch اولیه ( 48 ساعت ) غلظت بیومن به 1-gl1/37 رسد که حاوی %33 و MCL –poly3HA بود . پس از این زمان نیتروژن به صورت منبع محدود در آمد . به طور کل pooductivity معادل 1-gh1- h 25/0 بدست آمده است .
کشت در شرایط پیوسته با نرخ رشد 1-h 05/0 در اکثر productivity 1- gl 58/0و حداکثر غلظت بیومس 1-gh1- l58/0انجام شده ولی در شرایط محتوای MCL –poly3HA به 20% کاهش یافت . به نظر می رسد که توانایی نگهداری بیو پلیمر را کاهش می دهد .
برای بهتر شدن کار ، محیط های کشت برای نتیجه دادن چگالی حدود 1- gl 100 سلول تنظیم شدند . در شرایط fed – batch بیشینه ی غلظت بیومس به1- gl 12 و priductivity بیومس بهgl -1 8/1 افزایش یافت . اما productivity ، MCL –poly3HA پایین و در حدود 1-gh1- l34/0 بود . ارائه ی همین شرایط به محیط chemistat که در بالا معرفی شد نیز موجب افزایش درصد بیوپلیمر نشده و محتوای MCL –poly3HA در سلول در حدود 10% باقی مانده . علت پایین ماندن متحوای MCL –poly3HA در این شرایط هنوز مشخص نیست . فمانتاسیون fed –batch دیگری نیز با سوبسترای اکتانول و اکتانوآت انجام شد و در حضور اکسیژن خالص درصد MCL –poly3HA به %37 و pooductivity به 1-gh1- l 3/9 رسید . به علت تجمع سمی اکتانوآت غلظت های بالاتر بیومس غیر قابل دسترسی بود .
یک فرایند بهینه و کارا که برای تولید بیشتر MCL –poly3HA به کار گرفته شد شامل دو مرحله ی پیوسته بود . در مرحله‌ی نخست بیومس تولید شد و در مرحله‌ی دوم MCL –poly3HA در غیاب نیتروژن به %63 محتوای سلول به productivity ، 1-gh1- l06/1 رسید . این رقم بیشترین مقدار تولید شده ی MCL –poly3HA در pl oloeavoram تاکنون (1997) است .
p. putide
برای تولید MCL –poly3HA توسط p.putida ، برخلاف p.oleovoram نیازی نیست که باکتری حتما در شرایط کمبود منبع قرار داده شود . از طرف دیگر p.putida قادر به مصرف آلکان ها و آلکن ها نیست و در عوض از اسیدهای چرب به عنوان منبع کربن برای این باکتری استفاده شده است . از اسیدهای چرب نمی توان به عنوان فاز دوم در فرمانتور استفاده کرد چون غلظت بالای آنها برای باکتری ها سمی است . در شرایط پیوسته p . putida با استفاده از اولئیک اسید MCL –poly3HA را با محتوای %33 در غلظت 1-gl 30 و با pooductivity ، 1-gh1- l67/0 تولید کرده است .
برای آزمایش شرایط fed – bafch روی این باکتری نیاز بود که غلظت اسیدهای چرب به طریقی سنجیده و تنظیم شود که بالا رفتن آن باعث ممانعت از تولید نشده و پایین آمدن آن نیز ادامه رشد باکتری ها را محدود نکند . روش های HPLC برای سنجش ترکیبات آلیفاتیک معرفی شده اند ولی این روشها کارایی لازم را برای سنجش اسیدهای چرب طویل در محیط آبی ندارند . در عوض ، برای تامین شرایط مطلوب Exhansticn سوبسترا که به خاطر افزایش ناگهانی غلظت اکسیژن ایجاد می شد به عنوان سیگنالی برای وارد کردن مقداری اسید چرب ( به صورت یک پالس ) به محیط در نظر گرفته شد . به این ترتیب و مدت زمانی کمبود اسید چرب حداقل و امکان مسمومیت نیز کاهش یافت . با استفاده از اسیدهای چرب روغن نارگیل به عنوان سوبسترا در این مسمویت نیز کاهش یافت . با استفاده از اسیدهای چرب روغن نارگیل به عنوان سوبسترا در این فرایند1- gl131 بیومس پس از 36 ساعت بدست آمد که محتوی %59 MCL –poly3HA با pooductivity ،1-gh1- l3/2 بود که بالاترین میزان گزارش شده تاکنون است . همین آزمایش با اسیدهای چرب حاصل از ترکیبات دیگری نظیر با مخلوطی از آنها با موفقیت انجام شده است که امکان تولید MCL –poly3HA با مونومرهای مختلف فراهم ساخته است. این نتایج نشان می دهند که فرایند fed-batch برای p.putida مناسب است و بیومن پایین که در chemiytat ایجاد می شود ، cale – up آن را از لحاظ اقتصادی مشکل می کند.