مقدمه:
یکی از شاخصه های مهم درمان تشخیص صحیح و سریع عامل عفونی می باشد.
هم اکنون علم تشخیص جایگاه رفیعی در علم پزشکی پیدا کرده و سالیانه میلیاردها دلار سرمایه در جهت پیشرفت این علم هزینه می‌شود.
در بیماری های عفونی دستیابی به تشخیص صحیح باعث می‌شود که درمان توسط پزشک به نحو مطلوبی انجام گیرد.
که نتیجه آن ارتقاء سطح بهداشت عمومی و از سوی دیگر اعتماد و اطمینان بیمار و پزشک به آزمایشگاه است.
انواعی از بیماری های عفونی در انسان بوسیله ویروس ها ایجاد می شوند، برخی از این بیماریها فوق العاده کشنده بود، مثل هاری، هپاتیت، ایدز، تبهای هموراژیک و انسفالیت و برخی هم ناراحتیهای مختلفی در انسان ایجاد می‌کنند مثل سرماخوردگی، اوریون، عفونت با هر ویروس ها برخی مثل سرخچه و سیتومگالو ویروس ها ناهنجاریهای مادرزادی ایجاد می‌کنند بالاخره بعضی از ویروس ها تومور و سرطان ایجاد می‌کنند.
شیوع روز افزون بیماری های ویروس اهمیت و استفاده از روشهای پیشرفته در تشخیص این عوامل را بیش از پیش مطرح می سازد.
در سیر تکامل شعب مختلف علوم پزشکی رشته ویروس شناسی نیز مستثنی نبوده و پیوسته محققین آن در حال تکاپیو و تحقیق هستند که حاصل تجربیات آنها راهنمای ما در یافتن روشهای بهتر جهت تشخیص آزمایشگاهی بیماریهای عفونی است.
این دفتر تحت عنوان مروری بر روشهای ویروس شناسی با بررسی روشهای معمول ویروس شناسی به علاقمندان این رشته و دانشجویان علوم آزمایشگاهی و پزشکی تقدیم می‌گردد.
لازم است قید گردد این کتاب طوری طراحی شده و تنظیم شده که شخص علاقمند باید با مقدمات اولیه ویروس آشنایی داشته باشد.
مقدمه
تعداد زیادی از بیماریهای انسان، حیوان و گیاه با وجود اینکه واگیر و قابل انتقالند توسط باکتریها، قارچها، پروتزوئرها و به طور کلی توسط عواملی ایجاد می شود که نمی توان آنها را با میکروسکوپ عادی دید، و عفونی بودن اینگونه بیماریها را می‌توان با تزریق مواد آلوده ویا پالیده آنها به دامهای حساس به اثبات رسانید.
ویروسها ازجمله کوچکترین عوامل عفونی می باشند که به علت دارا بودن خصوصیات مختص خود با سایر موجودات زنده تفاوت دارند. ویروسها را نمی توان درمحیطهای مصنوعی آزمایشگاهی به راحتی تشخیص داد و بمنظور کشت، جداسازی و نهایتاَ شناسائی آنها از حیوانات حساس، تخم مرغ جنین دار و کشت سلول استفاده می شود. در اثر استفاده از تخم مرغ جنین دار برای کشت ویروسها پیشرفت قابل ملاحظه ای درراه شناسایی و جداسازی این عوامل عفونی حاصل شده است.
بیشتر ویروسها به میزبان ویژه ای اختصاص دارند به نحوی که دربدن میزبان اختصاصی نیز، بافت و یا سلولهای ویژه ای را جهت تکثیر و بقای خود انتخاب می‌کنند. با توجه به دارا بودن چنین شرایط انحصاری دراین دسته ازمیکروارگانیسمهای عفونی می توان بااستفاده از روشهای مخصوص و تکنیکهای مناسب تعداد زیادی از ویروسها را به رشد دربافت میزبان دیگر عادت داد.
نظر به اینکه یاخته ها و پرده های غشائی اطراف جنین مرغ مانند بیشتر بافتهای جنین فعالیتهای اختصاصی دقیقی ندارند رشد و تکثیر تعداد زیادی از ویروسها درآنها امکان پذیر می باشد.
تخم‌های مرغهای جنین دار که درمراحل گوناگون رشد می باشند با بکارگیری روشهای مختلفی می توان درآنها تلقیح نمود بعد از تلقیح تخم مرغها را درشرایط مناسب نگهداری نموده و هر روز بررسی می نمایند. روشهای استانداردی جهت تلقیح ویروسهای مختلف به غشاء کوریوآلانتوئیک، کیسه آمنیوتیک، کیسه آلانتوئیک، کیسه زرده یا جنین، داخل مغز جنین و داخل عضلانی موجود است. مایع یا بافتهای آنها را پس مدت زمان برداشته و تکثیر ویروس یا آسیب‌های ناشی از آن رابررسی می‌کنند.
واکنش بین ویروس ومیزبان خیلی اختصاصی بوده و از نظر بیولوژی ویروسها، بازتاب تنوع سلولهای میزبان آنها می باشد. تنوع دربین ویروسها به روشهای گوناگونی که ویروسها برای تکثیر و باقی ماندن ازخود نشان می دهند بستگی دارد.
درزمینه کشت ویروسها نیز قدمهای مهم و با ارزشی برداشته شده است تلقیح به تخم مرغ یا استفاده از کشت سلول که به ترتیب توسط ودروف (Woodruff) و پارکر (Parker) انجام پذیرفت ازمفیدترین روشهاست که برای رشد ویروسها به کاررفته است و درحال حاضر در آزمایشگاههای ویروس شناسی مورد استفاده می باشد پیشرفتهایی که درزمینه علوم بیوفیزیک، بیوشیمی، ایمنی شناسی و ژنتیک حاصل شده، به شناخت ماهیت ویروسها کمک قابل توجهی کرده است. استفاده از دستگاههایی نظیر میکروسکوپ الکترونی، اولتراسانتریفوژ، میکروسکوپ فلورسنت و اولترافیلتر درپیشبرد ویروس شناسی بسیار موثربوده است.
روشهای مختلف تشخیص آزمایشگاهی بیماریهای ویروسی برسه اصل استوار است
1. جداسازی ویروس
2. روشهای سرمی
3. روشهای ملکولی
1-1 جداسازی ویروس
برای کشت و جداکردن ویروسها معمولاً ازحیوانات حساس، تخم مرغ جنین دار ویا کشت سلول استفاده می شود. نمونه های مایع را که عاری از باکتری باشند می توان مستقیماً و یا پس از رقیق کردن به محیط زنده تلقیح نمود. نمونه های جامد را باید درمحلول تامپون به نسبت 20-10 درصد به صورت تعلیق درآورد. سپس توسط سانتریفوژبا دورکم ذرات معلق راجدا ساخت و مایع را دوباره سانتریفوژ کرده و سپس اقدام به کشت نمود.
1- ا- الف-کشت درتخم مرغ جنین دار
دراثر استفاده از تخم مرغ جنین دار برای کشت ویروسها پیشرفت قابل ملاحظه ای درراه شناسایی و جداسازی این عوامل بوجود آمده است. نظر به اینکه بافت ها و پرده های غشایی اطراف جنین مرغ مانند بیشتر بافتهای جنین فعالیتهای اختصاصی دقیقی ندارند، رشد تعداد زیادی از ویروسها درآنها امکان پذیر می باشد.
1-1- ب - جداکردن درکشت سلول
پیشرفتهای حاصل درکشت سلول وسیله با ارزشی برای جداسازی و تکثیر ویروسها در اختیار ویروس شناسان قرارداده است. ازدیاد ویروس درکشت سلول را می توان به روشهای مختلف ازقبیل اثر بیماری زائی درسلول(CPE) تداخل ویروسها(Interference)، جذب گلبولهای قرمز به یاخته های حاوی ویروس (Hemadsorption) هماگلوتنیشن(HA)، جستجوی آنتی ژن توسط ایمونوفلورسنت و یا ثبوت مکمل (CFT) تشخیص داد.
1-1-ج - کشت و جداکردن ویروس درحیوانات
انتخاب حیوان حساس برای جداکردن ویروس نکته اصلی دراین روش است که دراین رابطه فاکتورهای ضروری زیررا می بایست درنظر گرفت.
1-سن حیوان
2-میزبان طبیعی ویروس
3-منشأ حیوان
درحال حاضر ازاین روش به ندرت استفاده می شود و بیشتر دربررسیهای ویروس شناسی کاربرد دارد.
2-1- تشخیص بیماریهای ویروسی توسط آزمایشهای سرمی
عفونتهای ویروسی معمولاً با واکنشهای ایمنی هومورال و سلولی همراه است، بنابراین سنجش هر یک ازآنها وسیله ای برای تشخیص بیماری می باشد.
ازجمله آزمایشات سرمی متداول می توان به موارد زیر اشاره کرد:
1-آزمایشهای خنثی سازی(NT)
2-واکنش ثبوت مکمل (CFT)
3-واکنش جلوگیری از جمع شدن گلبولهای قرمز(HI)
4-واکنش ایمودیفوژن (I D)
5-واکنش ایمونوفلورسنس (FA)
6-آزمایش ELLSA
3-1- شناسایی بیماریهای ویروسی توسط آزمایشات ملکولی
تاریخچه تلقیح به تخم مرغ جنین دار
اولین بار دانشمندی به نام Good Pasture درسال 1913 به این فکر افتاد که عوامل عفونی را داخل تخم مرغ جنین دار کشت دهد تلاش برای ابداع این روش تا سال 1930 به طول انجامید. بخش عمده ای از ویروسهای حیوانی وانسانی را می توان به طور مستقیم و یا پس از عادت دادن درقسمتهای مختلف تخم مرغ جنین دارد تکثیر نمود. وسایل کار نسبتاً ساده بوده و مهارت لازم دراین زمینه را می توان درمدت زمانی معقول فراگرفت. امروزه بخش وسیعی از واکسنهای حیوانی و انسانی و بیش از 90 درصد واکسنهای طیور با این روش تهیه می گردد.
2-1- محاسن استفاده ازتخم مرغ جنین دار
1-دردسترس بودن تخم مرغ نطفه دار و روش انکوباسیون آسان آن
2-امکان انجام تزریق دربخشهای مختلف تخم مرغ جنین دار
3-عمل تلقیح ویروس حتی در آزمایشگاههای با امکانات کم در شرایط مناسب قابل اجراست.
4-امکان نفوذ آلودگی ازخارج به داخل تخم مرغ بسیار کم است.
5-میزان تکثیر ویروس درداخل تخم مرغ جنین دار معمولاً زیاد است.
2-2 منبع تهیه تخم مرغ
منبع تهیه تخم مرغ برای کارهای دقیق ویروسی و تولید واکسن، گله های SPF می‌باشد ولی برای کارهای روتین می توان از گله های مادر پاک با مدیریت خوب استفاده نمود. باید توجه داشت که تخم مرغ جنین دار ممکن است حامل عوامل میکروبی و ویروسی مانند سالمونلا، مایکوپلاسما، انسفالومیلیت، لکوز طیور، نیوکاسل، هپاتیت ویروسی و غیره باشد.
بهتر است تخم مرغ نطفه دار را بلافاصله درانکوباتور مخصوص قرارداده تا جنین رشد کرده و درسن مطلوب مورد تزریق قرارگیرد. اما می توان آنرا به مدت 5 الی 6 روز به طور مطلوب در 18-15 درجه و درصورت لزوم 15 الی 20 روز در 12 درجه سانتیگراد توأم با کاهش احتمالی میزان باروری نگهداری نمود. بدیهی است وجود اطلاعاتی درمورد گله تولید کننده ازقبیل برنامه واکسیناسیون، عیار آنتی بادی، بیماری های گله و داروهای مورد استفاده درقبل یا درهنگام تولید برای ویروس شناس بسیار مفید خواهد بود. آگاه بودن از آلودگی ویروسی و عیار آنتی بادی باعث می شود که تزریق با دقت کافی ودرمحل مناسب صورت پذیرد به فرض مثال در آلودگی با نیوکاسل نباید تزریق را درکیسه زرده انجام دهیم.
معمولاً تخم مرغ نطفه دار درماشین جوجه کشی که قبلاً ضدعفونی شده دردرجه حرارت و رطوبت مناسب قرار می گیرد تا رشد کند. ازانکوباتورهای معمولی نیز می‌توان استفاده نمود. به این ترتیب که درجه حرارت 5/37 الی 38 و رطوبت 40 الی 70 درصد را تأمین نموده و تخم مرغها را روزی دوبار و ترجیحاً چهار بار با دست بچرخانیم. بعد از 5-3 روز اولین کندلینگ برای بررسی باروری تخم مرغ صورت گیرد دراین مرحله تخم مرغهای بدون جنین و یا دارای جنین مرده حذف شوند.
در 5-3 روزگی فقط آثار عروق خونی مشاهده می شود.
کندلینگ برای بار دوم قبل از تلقیح، بسته به نوع ویروس و راه تزریق درروزهای 8 و 10 و 11و 12 صورت می گیرد. بعد از تزریق محل تلقیح مسدود و تخم مرغها را به طور ثابت در همان درجه حرارت یا کمی پایین تر به مدت 2 الی 9 روز بسته به نوع ویروس قرار می گیرند. باید توجه داشت که تمام اجزای جنین تخم مرغ عفونی تلقی می‌گردد و به هنگام بازکردن نباید ازدریل یا دیسک کاربوراندوم استفاده کرد زیرا ایجاد ائروسل می‌نماید و بهتر است از پنس وقیچی استفاده نمود و عملیات مربوطه درزیر هود میکروبیولوژی انجام پذیرد.
البته پس از برداشت تخم مرغها آنها را به مدت 6-4 ساعت در 4 درجه سانیگراد قرار می دهیم. این عمل به منظور انقباض عروق و توقف جریان خون و به حداقل رساندن خونریزی درهنگام صورت می پذیرد سپس محتویات تخم مرغ به منظور بررسی حضور ویروس مورد بازرسی قرار می گیرد.
3-2 علائم رشد ویروس
برخی ویروسها تغییرات مورفولوژیکی بوجود می آورند درحالی که برخی دیگر باعث مرگ جنین و یا تولید هماگلوتینین ها می گردند. باید توجه داشت که جابجائی خشن و تزریق نامناسب و آلودگی باکتریائی می تواند موجب مرگ سریع جنین شود که درهمه موارد توأم با بوی گندیدگی نخواهد بود. و درموارد مشکوک باید کشت باکتریائی صورت گیرد.
4-2 ساختمان تخم مرغ جنین دارد
1-زرده: حاوی مواد غذایی از قبیل 48 درصد آب –5/17 درصد پروئین –5/32 درصد چربی –یک درصد کربوهیدرات – یک درصد املاح
2-کیسه زرده: باترشح آنزیمهائی محتویات زرده را به صورت محلول درآورده و برای جنین قابل استفاده می کند.
3-آمنیون: (مایع و غشاء) کیسه آمنیوتیک حاوی مایع آلبومینی به نام مایع آمنیوتیک می باشد که جنین درآن شناور می باشد.
4-الانتوئیس: شامل غشاء و مایع الانتوئیک می باشد. پرده الانتوئیک به عنوان سیستم گردش خون عمل می کند و وقتی کاملاً رشد کرد اطراف جنین را فراگرفته و آنرا احاطه می کند. پرده الانتوئیک ازروز سوم جنین شروع به تشکیل کرده و تا روز 12 تکمیل می شود.
اعمال غشاء الانتوئیک شامل:
الف-تنفس: بوسیله جریان خون اکسیژن به جنین رسانده ودی اکسید کربن آنرا می‌گیرد.
ب-دفع: این غشاء مواد دفعی حاصل ازعمل تصفیه کلیوی جنین را گرفته و درحفره الانتوئیک می‌ریزد.
ج-گوارش: به هضم آلبومین و جذب کلسیم ازپوسته تخم مرغ کمک می کند.
5-غشاء زیر پوسته آهکی:
این غشا نقش فیزیولوژیک با اهمیتی ندارد.
6-پوسته آهکی:
این پوسته ازخارج بوسیله لایه نازک کوتیکول پوشیده شده و عمدتاً ازکربنات کلسیم تشکیل شده است. کوتیکول سد محافظتی دربرابر عبور اجرام عفونی ایجاد می کند.
5-2 رشد جنین درسنین مختلف
درروز اول و دوم آثار بسیار ظریف عروق خونی قابل مشاهده است.
در روز سوم عروق خونی قابل مشاهده بوده و ممکن است جنین به صورت لکه کوچکی مشاهده شود.
درروز پنجم عروق خونی گسترش یافته و جنین قابل مشاهده می باشد.
ازروز هشتم به بعد موقعیت فضای آمینوتیک قابل تشخیص و تعیین است و درروز 14 به بعد جنین به صورت توده دیده می شود.
درروز 20-19 اطاقک هوائی مشاهده نمی شود.
6-2 راههای تزریق
داخل زرده : ازتخم مرغ 5 الی 7 روزه به منظور جداسازی، بلوتانگ-هاری-کلامیدیا
مایع آمنیوتیک: ازتخم مرغ 10 الی 12 روزه به منظور جداسازی آنفلونزای تیپ A و B
مایع الانتوئیک: ازتخم مرغ 9 الی 11 روزه به منظور جداسازی نیوکاسل.
پرده کوریولانتوئیک: ازتخم مرغ 10 الی 12 روزه به منظور جداسازی ویروس آبله.
داخل وریدی: ازتخم مرغ 11 الی 13 روزه به منظور جداسازی ویروس بلوتانگ وآربوویروسها.
داخل مغز جنین: درتخم مرغ 12 روزه به منظور جداسازی ویروس آنسفالیت.
داخل عضلانی:
7-2 موارد استعمال تخم مرغ جنین دار SPF درتشخیص ویروسها
الف-ویروسهائی که درتمام قسمتهای تخم مرغ جنین دار رشد می کنند.
1-طاعون مرغی
2-نیوکاسل
3-آنسفالیت اسب
ب-ویروسهائی که روی پرده کوریوالانتوئیک رشد کرده و ایجاد جراحات شدید می کنند.
1-آبله طیور
2-نیوکاسل
3-لارنگوتراکئیت
4-واکسین
5-آبله انسان
6-هرپس سیمپلکس
7-میکزومای خرگوش
ج-ویروسهائی که روی پرده کوریولاانتوئیک رشد کرده و ایجاد جراحات مختصر می کنند.
1-آنفلوانزای Aو B
2-لنفوگرانولوماتوز
3-لوپینگ ایل
4-ویروس بیماری کاره
5-سرخجه
د-ویروسهای که درروی پرده کوریوالانتوئیک رشد کرده و ایجاد جراحت نمی‌کنند.
1-هاری
2-سرخک
3-سرخجه
4-برونشیت عفونی
ه-ویروسهائی که درحفره الانتوئیک رشد می کنند.
1-گریپ A و B
2-سویه نوروتروپیک گریپ
3-پارا آنفوآنزا
4-طاعون مرغی
5-نیوکاسل
6-اوریون
7-پولیومیلیت تیپ II
و-ویروسهائی که درحفره آمنیوتیک رشد می کنند .
1-گریپ A و D و C
2-گریپ نورروتروپیک
3-پاراآنفلوانزا
4-نیوکاسل
5-اریون
6-گرانولوماتوزعفونی