روش اجرا
نوع مطالعه، جامعه مورد مطالعه و نمونه گیری
نوع مطالعه : توصیفی
جامعه مورد مطالعه : افراد اهداء کننده
تعریف انواع اهداء کننده :
اهداء کننده بار اول : به اهداء‌کننده‌ای گفته میشود که برای اولین بار مبادرت به اهداء خون کرده است.
اهداء کننده با سابقه : اهداء کننده‌ای است که سابقه یک بار اهداء خون در طی سالیان گذشته را داشته باشد.
اهداء کننده مستمر : اهداء کننده‌ای است که حداقل در طی یکسال دوبار به اهدای خون مبادرت نموده است.
روش نمونه گیری : نمونه گیری بصورت تصادفی ساده می‌باشد.
روش انجام کار : برای جمع آوری اطلاعات از افرادی که جهت اهدای خون مراجعه می‌کنند از روش مصاحبه مشاهده و آزمایش استفاده میشود و نمونه افرادی که HDSAG آنها باشد جهت مطالعه انتخاب میشود. ابتدا بر روی نمونه‌ها عمل استخراج DNA ویروس ؟ B انجام می‌پذیرد سپس با استفاده از پرایمر اختصاصی جهت ژن B و با استفاده از روش mested PCR ژنP تکثیر میشود آنگاه محصول PCR تعیین توالی میشود.
نحوه اجرای تحقیق : مطالعه انجام شده یک مطالعه قطعی می‌باشد که بر روی اهداء کنندگان خون 3 پایگاه یزد، اصفهان و کرمان انجام میشود به هنگام نمونه گیری از هر یک از اهداء کنندگان خون درخواست شد تا پرسش نامه‌ای را تکمیل نمایند کلیه مشخصات اهداء کنندگان شامل نام و نام خانوادگی، سن و جنس و تحصیلات و دفعات اهداء خون و عوامل و غیره ثبت و ضبط شده باشد (پرسشنامه صفحه بعد) و 120 نمونه خون HBSAG جهت مطالعه جمع آوری شد.
هدف تحقیق :
هدف اصلی این مطالعه تعیین ژنوتایپ ویروس هپاتیپ B در اهداء کنندگان 3 استان کرمان، یزد و اصفهان است.
برنامه آنالیز آماری که بر روی اطلاعات خام انجام گرفته است:
در این پژوهش پس از تعیین داده‌های خام بدست آمده و وارد کردن آنها به کامپیوتر و افزودن نتایج حاصل از آزمایشات انجام شده به آنها با استفاده از برنامه از نوشته شده (SPSS) جداول توصیفی گردیده‌اند برای تعیین ارتباط (معنا دار بودن) از آزمون cha square یا xf استفاده شد فرول آزمون به ترتیب زیر است :
درجه آزادی
اختلاف معنا دار p<0/05 در نظر گرفته شد.
آزمایش مولکولی :
برای تخمین ویروس هپاتیت B از روشهای سرولوژی و برای شناسایی‌اش از روش مولکولی استفاده میشود PCR برای شناسایی ویروس درخون روشی بسیار اختصاصی و حساس می‌باشد و حضور میزان کمی از DNA HBV ممکن است برای زمان طولانی مرسوم قابل بررسی باشد و ابزار مناسبی برای تشخیص DNA ویروس در خون مادر؛ جنین و مایع آمونیاک محسوب میشود به طور کلی DNA ی یکی از انواع PCR که در تعیین DNAی ویروس هپاتیت Bنیز به کار می‌رود nested PCR است که با پرایمرهای اختصاصی در برخی مطالعات استفاده شده است علاوه بر pcr nested از Red times PCR نیز برای تشخیص DNA HBV استفاده میشود.
به منظور انجام PCR در ابتدا باید به DNA HBV دست یافت. بنابراین استخراج DNA صورت می‌گیرد و پس از آن PCR انجام می‌گیرد و در نهایت جهت بررسی این که DNAی HBV در نمونه مورد بررسی حضور داشته است یا خیر از روش ژل الکتروفروز استفاده میشود.
استخراج DNA
از کمیت استخراج اسید نوکلئیک با خلوص بالا بر روی استخراج DNA HBV استفاده میشود این کمیت برای خالص سازی اسید نوکلئیک ویروس از سرم، پلاسما یا خون کامل پستانداران طراحی شده است.
پوشش لیپدی سلول پستاندارد در حضور پروتئیناز K و Glanidine تخریب میشود اسید نوکلئیک موجود در محیط آزمایش به طور انتخابی به فیبرهای شیشه‌ای مخصوص در سلولهای حاوی فیلتر متصل می‌شوند. در نهایت پس از طی مراحل شست و شو، ترکیبات سلولی حذف می‌گردد و اسید نوکلئیک خالص در اتصال با فیلتر باقی می‌ماند. افزودن بافر رقیق کننده باعث رها شدن اسید نوکلئیک از فیلتر میشود.
PCR
PCR یا واکنش زنجیره‌ای پلی مر از روش ساده و در عین حال ظریف است که برای تکثیر قطعه‌ای خاص از توالی DNA در شرایط آزمایشگاه کاربرد دارد. در این روش با انجام یک واکنش آنزیمی میلیون‌ها نسخه از توالی مورد نظر بدست می‌آید.
در 1971، روشی برای تکثیر یک منطقه از DNAی دو رشته‌ای با استفاده از دو آغازگر (Primer) ساختگی طراحی شده با وجود در دست بودن این مفهوم، روش استفاده مکرر از این امر برای انجام تکثیر Amplification تا 12 سال بعد، کری مولیس (kavy mullis) در بهار 1983 ، این ایده را در ذهن خود پرورش داده و در نهایت در 19910 م فرایند PCB را ابداع کرد. مطرح نشده بود مولیس در 1993 م، به خاطر این کشف موفق به دریافت جایزه نوبل گردید. روش PCR مطابق اسلوبی است که داخل هسته سلول برای برای از یاد DNA در زمان تقسیم رخ می‌دهد. در سلول زنده یک فرایند پیچیده ناشی از عملکرد بروتیشن‌های مختلف موجب همانند سازی ژنوم می‌گردد که در ساده ترین تعریف می‌توان گفت در همانند سازی DNA دو رشته از هم گسیخته میشود و هر رشته از مولکول اولیه به عنوان الگوی ساخت رشته مکمل به کار می‌رود. همانند سازی در این مرحله بر اصل ارائه شده واتسون – که یک استوار است؛ اصلی که بیان میدارد نوکلئوتید A همواره با نوکلئوتیدT ، و نوکلئوتیدC با نوکلئوتید G جفت میشود (saiki et al 1985)
در PCR، یک سیستم بافری وجود دارد که در آن DNA پلیمر از توالی خاصی از مولکول DNA را تکثیر می‌دهد. در این سیستم اکسی نوکلئوتیدها به عنوان واحدهای ساختمانی برای ساخته شدن رشته جدید به کار می‌روند. در این میان پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی اختصاصی ناحیه‌ای خاص از رشته الگو را برای همانند سازی برجسته می‌سازند.
PCR سه مرحله دارد که با استفاده از تغییرات دما انجام میشود.
1- تقلیب (Donaturation) در این مرحله، DNA الگوی دو رشته‌ای بوسیله گرما تقلیب میشود. عموماً این کار در دمای ْc95 صورت می‌گیرد.
2- به هم پیوستن Annavling مخلوط واکنش تا رسیدن به دمای اتصال به سرعت سرد میشود و در این حالت امکان اتصال و هیبرید شدن پرایمرها را با الگو فراهم می‌آورد. در این مرحله آنزیم DNA پلی مر از مقاوم به گرما می‌تواند فرایند تکثیر را آغاز کند.
3- ساخت DNA : با توجه به دمای بهینه کارکرد آنزیم DNA پلی مر از مقاوم گرمایی، مخلوط واکنش، تا Cْ72 گرم میشود تا تکثیر DNA انجام شود.
مهمترین متغیرهای تاثیر گذار در اختصاصی بودن یک واکنش PCR عبارتند از دمای به هم پیوستن، برنامه و تعداد چرخه و ترکیب بافر اختصاصیت بالا در PCR با بهینه کردن موارد زیر حاصل میشود.
غلظت بهینه Mg+2 سایر یون‌ها، پرایمرها، DNTP ها وdna پلی مر از
تقلیب موثر، دماهای اتصال بالا و بالا بودن سرعت تغییر دما (Ramping Rate)
محدود کردن تعداد چرخه‌ها و طول مدت آنها
کلایی دستگاه ترموسایکلر
افزودنی‌های PCR
کیفیت الگو
Nested PCR (2006 Mcpherson et al.)