جداسازی بوسیله کروماتوگرافی
اهمیت روش کروماتوگرتافی به دقت زیاد آن است که می تواند مقدار بسیار کم مواد موجود در عصاره سلولی را تفکیک کند. اساس این روش بر جابجایی ذرات موجود در یک بخش متحرک بر روی یک بخش جامد است. سرعت جابجایی مواد موجود در بخش متحرک با درشتی مولکول ها، جرم مولکولی آنها و میل ترکیبی مواد بستگی دارد در نهایت نمونه بر حسب درشتی و جرم مولکولی در جایگاههای خاصی از بخش ثابت جایگزین می شود.
کروماتوگرافی روی کاغذ
انواع جداسازی های مختلف و ساده بر روی کاغذ به عنوان پیشروان کروماتوگرافی کاغذی توصیف شده اند.
در این روش فاز ثابت یک محیط آبی است که مولکولهای آن با رشته های سلولی کاغذ کروماتوگرافی پیوندهای محکمی دارد و فاز متحرک یک حلال آلی است که با خاصیت موئینگی از خلال کاغذ عبور می کند. در این روش قطره ای از محلول حاوی مخلوطی که باید جدا شود را روی سک صفحه یا نوا کاغذ صافی در محل علامت گذاری شده قرار می دهند. در این محل، قطره به صورت یک لکه حلقوی پخش می‌شود. وقتی که لکه خشک شد، کاغذ را در یک ظرف مناسب سربسته طوری قرار می دهند که یک سر آن در حلال انتخاب شده به عنوان فاز متحرک فرو رود (لکه نباید توی محلول قرار گیرد چون لکه از کاغذ شسته می شود). حلال از طریق الیاف کاغذ در نتیجه کاغذ در نتیجه عمل موئینگی نفوذ می کند و اجزا مخلوط را به میزانهای مختلف در جهت جریان حمل می کند. نکته مهم این است که سطح کاغذ نباید کاملاً بوسیله حلال پوشانده شود، زیرا در این صورت اصلاً جداسازی صورت نمی گیرد و یا نواحی خیلی پخش می شوند. وقتی که حبهه حلال مسافت مناسبی را طی کرد یا بعد از یک زمان قابل قبول، کاغذ را از تانک بیرون آورده، جبهه حلال را با علامتی مشخص می کنند و مهلت می دهند تا کاغذ خشک شود.
اگر اجسام رنگی؛ باشند به صورت نواحی یا لکه هایی مجزا مشخص شوند. هدف این است که لکه ها فشرده و جدا از هم باشند. اگر لکه رنگی نبوده باید به روشهای شیمیایی یا فیزیکی آن را تشخیص داد.(استفاده از واکنشگر مکان یاب یا ماورابنفش) ساده ترین روش شناسایی بر اساس Rf یعنی نسبت فاصله طی شده بوسیله لکه تقسیم بر فاصله طی شده جبهه حلال است.
برای تفکیکی مطمئن تر، از کروماتوگرافی کاغذی دو بعدی استفاده می کنیم. در این حالت پس از اینکه مرحله اول کروماتوگرافی تمام شد. کاغذ صافی را با زاویه 90 درجه می چرخانیم و مجدداً با حلال دیگری عمل گروماتوگرافی را پی می گیریم در نتیجه این عمل تفکیک مخلوط مورد نظر، بسیار دقیق تر صورت می گیرد.
موارد استعمال کروماتوگرافی کاغذی:
1- جدا سازی آمینواسید ها و پپتیدها در بررسی ساختارهای پروتئین ها
2- آزمایش روزمره ادرار و سایر مایعات بدن برای اسید آمینه ها و قندها
3- جداسازی بازهای پورین و نوکلئوتید ها در آزمایش اسید نوکلئیک
4- جداسازی استروئید ها
5- جداسازی ترکیبات علامت دار بوسیله رادیوایزوتوپ ها
مواردی که در جداسازی بوسیله کروماتوگرافی کاغذی موفق نبودند:
1- جداسازی اجسام فرار غیر فعال مانند هیدروکربن ها
2- اسیدهای چرب فرار
کروماتوگرافی لایه نازک
در این روش که همان کروماتوگرافی اصلاح شده است، جاذب به صور لایه نازکی با ضخامت یکنواخت روی یک تکیه گاه صت بی اثر پخش می شود که معمولاً از صفحات شیشه ای استفاده می کنند. جاذب جامد به صورت پودر ریز را معمولاً با آب و گاهی با یک مایع آلی فرار به صورت خمیز در می آورند و آن را بوسیله دستگاههای پخش کننده تجاری یا یک پخش کننده خانگی یا حتی با دست روی صفجه پخش می کنند. (حتی با پاشیدن یا فرو بردن نیز امکان پذیر است) صفحه پوشیده از خمیر را خشک و با گرم کردن آن در حدود 100 درجه به مدت از قبل تعیین شده، آن را فعال می کند.
محلولی از نمونه در یک حلال فرار را به وسیله پیپت یا روی صفحه قرار می دهند.
وقتی که لکه خشک شد صفحه را به طور عمود در تانک سرنگ طوری قرار می دهند که لبه پایینی آن در فاز متحرک انتخاب شده فرو رود، بدین ترتیب جدا سازی با استفاده از کروماتوگرافی صعودی انجام می شود.
در پایان، حلال را از صفحه تبخیر می کنند و لکه های جدا شده را بوسیله روشهای فیزیکی یا شیمیایی شبیه روش کروماتوگرافی کاغذی آشکار و شناسایی می کنند.
مزایای کروماتوگرافی لایه نازک نسبت به کروماتوگرافی کاغذی
1-سریع بودن آن یعنی زمان متوسط حرکت حلال به مقدار cm10 در کروماتوگرافی لایه نازک روی سیلیکاژل30-20دقیقه است‌ولی‌روی کاغذ حدود2 ساعت‌طول‌می‌کشد.
زمان تقریبی جداسازی روی صفحات کوچک تر حدود 5 دقیقه است.
2- چون می توان از واکنشگرهای فعال تری همچون اسید سولفوریک غلیظ استفاده کرد تفکیک اجزا مخلوط بهتر انجام می شود
معایب کروماتوگرافی لایه نازک نسبت به کروماتوگرافی کاغذی:
1- اشکال زیاد در قبت و نگهداری کروماتوگرافی لایه نازک
2- عدم سهولت بدست آوردن مقدار تکرارپذیر.
البته هر دو عیب را می توان به حداقل رساند و این عیوب برای کم کردن برتری همه جانبه کروماتوگرافی لایه نازک نسبت به سایر انواع کروماتوگرافی (به جز کروماتوگرافی گازی) کافی نیستند.
موارد استعمال کروماتوگرافی لایه نازک
جداسازی اسیدهای چرب اشباع و غیر اشباع، تری گلیسیریدها، استروتیدها،
فسفولیپدها، نوکلئوتیدها، پتپدها و مواد مختلف بیولوژیک.
کروماتوگرافی تعویض یونی
در این روش از استوانه های شیشه ای که توسط دانه های رزین پر شده اند، استفاده می شود.
رزین های مورد نظر پلی مرهایی هستند که گروههای یونیزه شونده بسیاری به آنها افزوده شده است.
وقتی که محلولی از یونها از درون این استوانه ها(ستون ها) عبور می کند، یونها برای چسبیدن به جایگاههای باردار رزین تلاش می کنند. در نتیجه سرعت عبور هر یون از داخل ستون به میل ترکیبی آن با محل های بردار رزین، درجه یونی شدن آن و ماهیت و غلظت یونهای رقابت کننده در محلول بستگی دارد اختلافی که در سرعت عبور یونها از داخل ستون وجود دارد مبنای اصلی جداسازی پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک توسط این روش است.
انواع رزین هایی که بار منفی دارند را تبادل کنندگان کاتیونی و انواع رزین هایی که بار مثبت دارند را تبادل کنندگان آنیونی می نامند. مهم ترین رزین هایی که برای جداسازی پروتئین ها استفاده می شود، دی اتیل آمینواتیل سلولز به عنوان تبادل کننده آنیونی و کربوکسی متیل سلولز به عنوان تبادل کننده کاتیونی هستند.
تقابل بین رزین و پروتئین ایجاد پیوند الکترواستاتیکی بین ذرات رزین و زنجیزه جانبی برخی اسیدآمینه های پروتئین می کند و چون تعداد این پیوندها زیاد است
پروتئین ها محکم به ذرات رزین می چسبند.
(نمودار و جداول در فایل اصلی موجود است)