تحقیق مقاله روش شناسائی یرسینیا انتروکلی تیکا

روش شناسائی یرسینیا انتروکلی تیکا

در مواد غذائی

-0 مقدمه

جنس یرسینیا با پذیرفتن نام‌های متعددی چون فلاوباکتریوم پسودومولئی، باکتریوم انتروکلی تیکا، پاستور لاپسودوتوبرکلوزیس، پاستور X و ژرم X نهایتا از سال 1974 از خانواده پاستور لاسه جدا و به همراه سه گونه اصلی یرسینیاپستیس، یرسینیا پسودوتوبرکلوزیس و یرسینیا انتروکلی تیکا بطور قطعی در خانواده آنتروباکتریا سه جای گرفت.

این باکتریها از جمله بیماری زاهای مشترک انسان و دام هستند و مهم ترین گونه‌ای که نقش آن در بیماری زایی انسان از سال 1965 به اثبات رسیده است یرسینیا انتروکلی تیکا می‌باشد، شیر خام، گوشت، سبزیجات و آب می‌تواند بعنوان منبع آلودگی این باکتری مطرح باشد.

یرسینیا انتروکلی تیکا می‌تواند عامل بیماری معدی روده‌ای، آدنیت مزانتریک، اریتم گره‌دار عفونت خونی و پلی آرتریت باشد. این ارگانیسم، کوکو باسیلی است گرم منفی، بدون کپسول، بی‌هوازی اختیاری بطول 1-3 میکرومتر و عرض 0/5 - 0/8 میکرومتر که حرکت آن فقط در دمای پائین تر از 30 درجه سلسیوس به کمک فلاژل‌های پیرامونی صورت می‌گیرد. دمای مناسب رشد آن 28-29 درجه سلسیوس PH مناسب آن 7/2 - 7/4 است و مانند اکثر آنتروباکتریاسه‌ها گلوکز را بدون گاز تخمیر می‌کند و اکسیداز منفی است.

سروتیپ‌های جدیدی چون 0:13a; 13b, 0:4,32, 0:5,27, 0:21 بیماری‌زا تشخیص داده شده‌اند. بیشترین سروتیپ‌های بیماری‌زا 0:3 0:8, 0:9 می‌باشد.

از نظر سرولوژی آگلوتیناسیون‌های متقاطع با ارگانیسم‌هایی مانند سالمونلا، بروسلا، شیگلا، اشری شیاکلی و ویبربو گزارش شده است.

 1 هدف و دامنه کاربرد

 هدف از تدوین این  استاندارد ارائه روش جداسازی  و شناسایی  یرسینیا انتروکلی تیکای بیماری زا برای انسان است . این روش در مورد فرآورده‏های  غذایی انسان  و دام کاربرد دارد . 2 واژه‏ها و تعاریف در این استاندارد  واژه‏ها با تعاریف زیر بکار می‏روند :

 هدف از تدوین این  استاندارد ارائه روش جداسازی  و شناسایی  یرسینیا انتروکلی تیکای بیماری زا برای انسان است . این روش در مورد فرآورده‏های  غذایی انسان  و دام کاربرد دارد .

 2 واژه‏ها و تعاریف

 در این استاندارد  واژه‏ها با تعاریف زیر بکار می‏روند : 2 1 یرسینیا آنتروکلی تیکای بیماری زا باکتریهای  سرما گرایی هستند که اگر طبق روش مشروح در این استاندارد آزمایش شوند روی محیط های جامد انتخابی پرگنه‏های ویژه‏ای ایجاد می‏نمایند که از نظر خواص بیوشیمیایی با معیارهایی بیماری زائی این استاندارد مطابقت می‏کند .

 در این استاندارد  واژه‏ها با تعاریف زیر بکار می‏روند :

 2 1 یرسینیا آنتروکلی تیکای بیماری زا

 باکتریهای  سرما گرایی هستند که اگر طبق روش مشروح در این استاندارد آزمایش شوند روی محیط های جامد انتخابی پرگنه‏های ویژه‏ای ایجاد می‏نمایند که از نظر خواص بیوشیمیایی با معیارهایی بیماری زائی این استاندارد مطابقت می‏کند .

 2 2 شناسایی یرسینیا آنتروکلی تیکا

 شامل حضور یا عدم حضور این باکتری در مقدار معینی از فرآورده غذایی است که بر طبق روش مشروح در این استاندارد تعیین می‏شود .

 3 اساس آزمایش

 شناسایی یرسینیا آنتروکلی تیکای  احتمالا بیماری زا در طی سه مرحله پی در پی زیر صورت می‏گیرد . 3 1 غنی سازی در محیط مایع انتخابی 3 1 1 کشت نمونه مورد آزمون در دو محیط غنی کننده زیر :

 شناسایی یرسینیا آنتروکلی تیکای  احتمالا بیماری زا در طی سه مرحله پی در پی زیر صورت می‏گیرد .

4 محیطهای کشت ومعرف های لازم

 4 1 کلیات  بدلیل تعداد زیاد محیطهای کشت  و معرف‏ها و برای وضوح شرح آزمایش , ترکیبات  محیطها , جزییات مربوط به تقسیم  و نگهداری آنها به صورت پیوست در استاندارد آمده است . 4 2 محیطهای غنی کننده

 4 1 کلیات

 بدلیل تعداد زیاد محیطهای کشت  و معرف‏ها و برای وضوح شرح آزمایش , ترکیبات  محیطها , جزییات مربوط به تقسیم  و نگهداری آنها به صورت پیوست در استاندارد آمده است .

 4 2 محیطهای غنی کننده

 4 2 1 محیط مایع حاوی پیتن , سوربیتول و نمکهای صفرا (PSB)

 4 2 2 محیط مایع حاوی ایرگازان تیکارسیلین  وکلرات پتاسیم (ITC)

 4 3 محیطهای کشت

 4 3 1 سفسولودین ایرگازان  و نووبیوسین حاوی آگار (CIN)

 4 3 2 سالمونلا شیگلا آگار حاوی ذرکسی کلات سدیم و کلرور سدیم (SSDC)

 4 3 3 نوترنیت آگار

 4 4 محیط های  شناسایی ومعرفها

 4 4 1 محیط  کشت اوره تریپتوفان

 4 4 2 معرف شناسایی تریپتوفان  دی آمیناز

 4 4 3 کلیگر آگار

 4 4 4 معرف تشخیص اکسیداز

 4 4 5 محیط های کشت دکربوکسیلاز

 4 4 5 1 محیط  کشت لایزین دکربوکسیلاز

 4 4 5 2 محیط  کشت اورنی تین دکربوکسیلاز

 4 4 6 محیط  برای  تخمیر قندها ( ساکارز ( رامنوز یا سالیسین )

 4 4 7 محیط  سیمون سیترات

 4 4 8 محیط  صفرا و اسکولین  آگاردار

 4 4 9 کازئین سویا اگاردار

 4 4 10 کارتین سویا آگار دار برای شناسایی آمیداز

 4 4 11 محلول سولفات  آمونیوم و آهن دو ظرفیتی برای شناسایی پیرازین آمیداز

 مازئین  سویا آگاردار حاوی منیزیم وآگزالات

 4 5 سرم فیزیولوژی

 4 6 پتاسیم  هیدروکساید در سرم فیزیولوژی

 4 7 محیط SIM آگار

 5 وسایل  ضروری

 یادآوری : بجای ظرف شیشه‏ای  چند بار مصرف از وسایل یکبار مصرف بشرط دارابودن ویژگیهای مناسب می‏توان استفاده کرد. . 5 1 وسیله سترون کردن خشک ( آون ) یا سترون کردن مرطوب ( اتوکلاو ) 5 2 گرمخانه قابل تنظیم در 22±1درجه سلسیوس و 25±1درجه سلسیوس.

 یادآوری : بجای ظرف شیشه‏ای  چند بار مصرف از وسایل یکبار مصرف بشرط دارابودن ویژگیهای مناسب می‏توان استفاده کرد. .

 5 1 وسیله سترون کردن خشک ( آون ) یا سترون کردن مرطوب ( اتوکلاو )

 5 2 گرمخانه قابل تنظیم در 22±1درجه سلسیوس و 25±1درجه سلسیوس.

 5 3 قفسه خشک کردن یا آون دارای تهویه  هوا با جابجایی و قابل  تنظیم در 37±1 درجه و 55±1 درجه سلسیوس

 5 4 حمام  آب قابل  تنظیم  در دمای 45±0/5درجه سلسیوس و 50±0/5درجه سلسیوس

 5 5 لوله‏های آزمون  با ابعاد 180*18 و 180*9 و 50*12 میلی متر

 5 6 ظروف شیشه ای و بطری های با گنجایش مناسب

 5 7 ظروف پتری شیشه‏ای  یا پلاستیکی  بقطر 100 90 میلی متر

 5 8 پی پت‏های 1 و 10 میلی لیتری با درجه بندی 0/1 میلی لیتر

 5 9 مکنده‏های لاستیگی ( پوآر ) مخصوص پی پت

 5 10 حلقه کشت  بقطر تقریبی 3 میلی متر و سوزن کشت  سر صاف از جنس پلاتین  / ایریدوم  یا نیکل / کروم  و یا پی پت پاستور شیشه‏ای  بجای سوزن کشت .

 یادآوری : حلقه و سوزن کشت یکبار مصرف می‏تواند استفاده شود حلقه کشت از جنس نیکل / کرم برای انجام آزمون اکسیداز مناسب نیست .

 5 11 PH متر بادقت ±0/1 واحد PH در 25 درجه سلسیوس

 5 12 منبع نور مناسب برای تابش مورب

 5 13 ذره بین یا میکروسکوپ

 5 14 مخلوط کن ( استوماکر )

 6 نمونه برداری

 نمونه برداری از فرآورده باید با رعایت  اصول مربوط به نمونه برداری فرآورده  غذایی برای آزمایش‏های  میکربی صورت گیرد . نمونه‏ای که به آزمایشگاه می‏رسد باید معرف واقعی کالا بوده و در حین  نمونه برداری و حمل و نقل دچار آسیب دیدگی و تغییر نشده باشد . 7 آماده کردن نمونه نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد  ملی شماره 356 ایران  (( آماده کردن نمونه غذایی و تهیه رقم اعشاری نمونه برای آزمایش های میکربی )) آماده شود .

 نمونه برداری از فرآورده باید با رعایت  اصول مربوط به نمونه برداری فرآورده  غذایی برای آزمایش‏های  میکربی صورت گیرد . نمونه‏ای که به آزمایشگاه می‏رسد باید معرف واقعی کالا بوده و در حین  نمونه برداری و حمل و نقل دچار آسیب دیدگی و تغییر نشده باشد .

 7 آماده کردن نمونه

 نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد  ملی شماره 356 ایران  (( آماده کردن نمونه غذایی و تهیه رقم اعشاری نمونه برای آزمایش های میکربی )) آماده شود . 8 روش آزمایش 8 1 سوسپانسیون‏های  اولیه

 نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد  ملی شماره 356 ایران  (( آماده کردن نمونه غذایی و تهیه رقم اعشاری نمونه برای آزمایش های میکربی )) آماده شود .

 8 روش آزمایش

 8 1 سوسپانسیون‏های  اولیه 8 1 1 مقدار معینی ( وزن ی حجم نمونه ) از نمونه مورد آزمایش را به حجم مشخصی از محیط PSB منتقل کنید بطوری که رقت یکدهم  وزن به حجم یا حجم به حجم بدست آید و بعد با استوماکر آن  را مخلوط کنید تا یکنواخت شود . 8 1 2 سوسپانسیون  دیگری از نمونه , با محیط ITC با رقت  وزن به حجم  یا حجم به حجم تهیه کنید .

 8 1 سوسپانسیون‏های  اولیه

8 1 1 مقدار معینی ( وزن ی حجم نمونه ) از نمونه مورد آزمایش را به حجم مشخصی از محیط PSB منتقل کنید بطوری که رقت یکدهم  وزن به حجم یا حجم به حجم بدست آید و بعد با استوماکر آن  را مخلوط کنید تا یکنواخت شود .

 8 1 2 سوسپانسیون  دیگری از نمونه , با محیط ITC با رقت  وزن به حجم  یا حجم به حجم تهیه کنید .

 8 2 غنی سازی 1

 8 2 1 محیط PSB کشت شده  را در 25 22 درجه سلسیوس بمدت 5 روز  بدون هم زدن  و 2 تا 3 روز با هم زدن قرار دهید .

 8 2 2 محیط ITC کشت شده را  در 25 درجه سلسیوس برای 2 ورز (48 ساعت ) گرمخانه گذاری  کنید .