تحقیق مقاله جدا سازی محصولات طبیعی آبزی

پیشگفتار :

اقیانوس ها در جهان بیش از 70% سطح زمین را می پوشانند و دارای بیش از 200000 بی بهره و گونه های جلبکی هستند . این ارگانیسم ها در جوامع پیچیده و در ارتباط نزدیک با دیگر ارگانیسم ها زندگی می کنند . چه به صورت ارگانیسم های ماکرو ( مانند جلبک ، اسفنج ، نرم  تنان پوشش دار و یا به صورت میکرو ( مانند باکتریهای غیررشته ای ، قارچ ها و آکتینوفایست ). بعضی از ارگانیسم ها مواد شیمیایی خود را از منابع غذایی به دست ‚ی آورند اگر چه مابقی آنها ترکیبات را دوباره سنتز می کنند . بعضی از ترکیبات ی توانند توسط میکرو ارگانیسم های مربوطه تولید شوند در حالی که مابقی آنها جهت تولید به یک ارتباط بین میزبان و میکرو ارگانیسم نیاز دارند . مواد شیمیایی یک نمونه خاص می توانند تحت تأثیر زیستگاه و عوامل فصلی و جغرافیایی باشد. در حقیقت منشاء واقعی بیوژنتیکی سنتز محصولات طبیعی آبزی در جامعه این محصولات یک موضوع مورد بحث است.

به علت تنوع ارگانیسم های آبزی و زیستگاهها ، تولیدات آبزی طبیعی طبقات شیمیایی زیادی را احاطه می کنند ( مانند ترین ها ) شیمیکیمات ها  ، پلی کتیو ها ، استوژنین ها ، پیتیدها، آلکالوئیدهای ساختارهای متفاوت و یک دامنه ای از ترکیبات بیوسنتز مخلوط ، در دهه گذشته به تنهایی ، ساختارهای بیش از 500 محصول طبیعی دریایی به چاپ رسیده اند.

در بسیاری از موارد طبقه ترکیب موجود در ارگانیسم می تواند بر اساس طبقه بندی ارگانیسم منبع پیش بینی شود . متأسفانه حتی  شناخت علم به طبقه ترکیب همیشه ما را در جهت تعیین یک ساز خالص سازی هدایت نمی کند . مجموعه هایی از محصولات طبیعی آبزی می توانند دارای چندین عامل شیمیایی باشند ( مانند oso3 – Na – Oac – och3 – oh ) . هرگونه تغییر در عامل می تواند تغییر اساسی در قطبیت ترکیبات ایجاد کند بنابراین روش مورد نیاز برای خاص سازی نیز تغییر خواهد یافت . به عنوان مثال نمونه های اسفنج ته دریایی با جنس Spomhosorites دارای آبیس ( ایندول ) آلکالوئید است. تاپستین ( طرح 1 ) ، ساده ترین ترکیب این مجموعه میتواند با کروماتوگرافی هر ژل سیلیکا با استفاده از مخلوطهای ckcl3  - Meoh به عنوان شوینده ، خالص گردد . در الگاسیدین  d ( طرح 2 ) ک دارای یک زنجیره جانبی . 2- آمینو ایمیدازول است که خیلی قطبی تر است وبه کروماتوگرافی بر فاز ثابت فاز معکوس و شسشه شدن با مخلوطهای اسید استونیتریل آب تری فلوئرواستیک ( TFA )  نیاز دارد . دراین حالت علم به طبقه ارگانیسم می تواند  در تعیین ساختار ترکیبات خالص کمک کند ولی در تعیین روش عالص سازی برای متابولیست قطبی تر که دارای یک عاملیت شمیایی غیر منتظره است کمکی نمی کند.

به منظور دسترسی به بینشی در مورد روش هایی که بیشتر در خالص سازی محصولات طبیعی آبزی استفاده می شوند 115 گزارش از این محصولات که در سال 1995 در روزنامه انجمن شمیمدانان آمریکا ، روزنامه شیمی آلی ، تتراهدرون و روزنامه محصولات طبیعی به چاپ رسیده بودند مورد بررسی قرار گرفتند . هر نشریه به طریق زیر طبقه بندی می شود:

شاخه ارگانیسم منبع .

طبقه ترکیبات شیمیایی گزارش شده.

روش حفظ ارگانیسم ( تازه / منحصر در مقابل خشک فریز کردن ) .

روش استخراج “ غیر قطبی ” حلال هایی مانند : CH2, CL2  ، هگزان ها ، استون ، ETAO 2 ، Eto2  ، تولئون ، اترنفت ؛ “ غیر قطبی و الکل ” هر یک از مواد فوق مخلوط با یک الکل ؛ “ الکل ” معمولاً اتانول ، متانول ، و یا ایزوپروپانول ؛ “ طرح پیچیده ” ؛ مانند استخراج متوالی و یا مخلوطهای غیر معمول خیلی پیچیده حلالها با “ آبی ”  100% آب یا مخلوطهای آب دیگر محلولها در حالی که آب بیش از 50% مخلوط را شامل باشد .

 روش مورد استفاده تقسیم حلال در صورت وجود این روش ها به طبقات زیر تقسیم می شوند :

الف “ ساده ” مانند یک تقسیم تک مرحله ای ( مثل یوتانول آب ) و یا تقسیم دو مرحله ای مانند ETOAC آب ) و به دنبال آن تقسیم بعدی فاز آبی با یوتانول.

ب) “ کوپکان ” شامل هر طرح واقعی ویا تغییر یافته کوپکان ( Kypchan ) که در آن درصد فاز آبی به طور متوالی تنظیم می شود.

ج ) “ پیچیده ” ( کمپکس ) : شامل هر طرحی که در آن یک توالی غیر معمول حلال ها و یا مخلوطهای کمپکس غیر معمول حلال ها استفاده می شوند مانند :

مخلوطهای هیپتان : ETOA : MEOH : CHCL3  : ACOH

که در جدا سازی با تزلیوین ها استفاده می شوند.

نوع کروماتوگرافی ستون باز ، درخششی ویا ستون خلاء. این ها به ژل سیلیکا ، فازهای پیوندی ( مانند  CN,Did, C-8 DDS ) ویا نفوذ ژل بر رزین های غیر عاملی تقسیم می شوند من جمله سیستم های کروماتوگرافی تقسیم و اندازه ه مانند ( SephadenLH- 20 ، SephadenLh- 60  ، Nsbels ، Bibeadssx-20 ، Sn-8 , sn-4 ، AMBERLIT EXAD – 2 ، XAD ، XAD- 7 ، ژل TSK- G3…S ) .

نوع روش HPLC مورد استفاده در صورت وجود این ها به فاز طبیعی ،‌فاز معکوس ( C-18 , C – 8, C-4 ) دیگر فازهای پیوندی مانند : ( NH2 , CN, DIOL ) ومواردی تقسیم می شوند که در آنها ترکیباتی از مثالهای فوق استفاده گردند.

 کروماتوگرافی مایع فشار میانی ( MPLc ) ، کروماتوگرافی جریان مخالف ( CCC ) ، و کروماتوگرافی لایه نازک تدارکاتی ( PILC )کدام یک استفاده می شوند.

 آیا هر یک از روش های دیگر نیز استفاده می شوند ( مانند  ترم سازی و بلور سازی ، تبادل آنیون / کاتیون ، فراصافی ) .

نتایج این بررسی در جداول 3-1 ارائه شده اند . جدول 1 : توزیع ترکیبات را در شاخه ها نشان می دهد.

جدول 2 – رایج ترین روش های خالص سازی شاخه های متفاوت رانشان می دهد . جدول 3 – رایج ترین روش های خالص سازی را  برای طبقات ترکیبات نشان می دد. تعدادی از نتایج حاصل عبارتند از :

نگهداری نمونه ها :

در 77 % گزارشات مواد تازه و منجمد استخراج شدند در 23 % گزارشات از ارگانیسم قبل از استخراج خشک فریز شد و یا در هوا خشک گردید.( دو نمونه ) .

استخراج :

رایج ترین حلال های استخراج عبارت بودند از الکل ها ( 46 % ) و یا مخلوطهای الکل و حلال های کم قطبی تر ( 25 % ) .

تقسیم سازی :

هیچ تقسیم حلالی در 28 % موارد استفاده نشد تقسیم های ساده در 41 % زمان انجام شدند. طرح های کوپکان ( kychan ) در 25 % زمان و طرح های کمپکس در 50 % زمان استفاده شدند.

کروماتوگرافی ستونی ( VCC ) ، درخششی ؤ و یا جاذبه باز ) :

الف ) در 10 % روندهای جداسازی از هیچ شکلی از کروماتوگرافی ستون باز استفاده نشد.

ب) در 65 % جداسازیها از فازهای ثابت ژل سیلیکا استفاده شد.

ج ) در 12 % جداسازیها از فازهای ثابت فاز پیوندی ( مانند CN1, DIOL , ODS ) استفاده شد .

د) در 10 % جداسازیها ازفازهای ثابت ،‌فاز پیوندی و ژل سیلیکا استفاده شد( یعنی مراحل چندگانه کروماتوگرافی ستونی استفاده گردید ) .

ذ ) در 46 % جداسازیها از کروماتوگرافی تراوش ژل بر رزین های غیر عاملی استفاده شد. LH – 20  در 42 % جداسازیها استفاده گردید .

ر) در 44 % جداسازیها فقط فازهای ثابت ، فاز معکوس و یا سیلیکا استفاده شد ( بدون کروماتوگرافی )

ز) در 13 % جداسازیها فقط از رزین های غیر عاملی استفاده شد مانند Sephadeax Lh – 20 ،

خ ) در 33 % جداسازیها از ترکیب کروماتوگرافی فاز پیوندی و یاسیلیکا وکروماتوگرافی بر رزین های غیر عاملی استفاده شد.

MPLC  در 90 % مطالعات استفاده شد.

CCC در 70 % مطالعات استفاده شد .

PTLC  در 10 % مطالعات استفاده شد.

 HPLC :

الف ) در 27 % جداسازیها از HPLC  استفاده نشد.

ب) در 60 % فقط فازهای ثابت فاز نرمال استفاده شد . ( مانندسیلیکا ) .

ج ) در 49 % فازهای ثابت ، فاز معکوس استفاده  شد. (PR-18, PR-8, PR-4 )   

د) در 10 % جداسازیهای چندگانه HPLC  بر فازهای ثابت ، فاز معکوس و طبیعی استفاده شد.

ذ) در 3 % دیگر فازهای پیوندی استفاده شدند . ( NH2 , DIOL , CN ).

ر) در 14 % مطالعات از دیگر روش های جداسازی استفاده شد مانند فرم سازی ، بلورسازی ، فراصافی و یا کروماتوگرافی تبادل آنیون / کاتیون .

1-1 : روش کلی مورد استفاده در HBOI :

این فصل یک طرح کلی است از روش کلی مورد استفاده در آزمایشگاه  مؤلف جهت خالص سازی کردن محصولات طبیعی دریایی. یک طرح در شکل 1 آمده است . در روش ها تمام جداسازیها در یک مقیاس کوچک انجام می شوند تا این که ترکیب خالص به طور تکرار پذیر جدا شود. تعدادی روش خالص سازی برای تضمین جداسازی مقام ترکیبات مورد نظر استفاده می شوند و مقام اجزاء یا سنجض زیستی ، ILC-  و یا HPLC ، NMR شناسایی می گردند . روند کلی ما شامل مراحل زیر است :

جمع آوری و شناسایی میدانی ارگانیسم آبزی.

استخراج اولیه ارگانیسم .

سنجش یبولوژیکی عصاره اسخراجی.

تقسیم جهت تأیید و غنی کردن فعالیت زیستی .

تعیین قطبیت محصولات طبیعی موجود در عصاره و یا derplicatixn ترکیبات معلوم.

 انتخاب اولین مرحله کروماتوگرافیک بر اساس قطبیت.

کروماتوگرافی بیشتر.

توسعه جداسازی یک HPLC درصورت امکان .

افزایش مقیاس جداسازی برای آزمایش بیشتر بیولوژیکی و یا تشخیص ساختار.

2- جمع آوری و ذخیره ارگانیسم های آبزی .

1-2 کنترل ارگانیسم های آبزی :

ارگانیسم های آبزی منبع هزاران محصول طبیعی مختلف هستند . بسیاری از این ترکیبات در سیستم های پستانداران بی نهایت سعی بوده اند. به عنوان مثال پالی توکسین که در ابتدا در زوآنتید Palythoa  toxica یافت شد یکی از مهمترین ترکیبات غیر پروتئینی کشف شد تا امروز می باشد . حوض جزر ومدی که در آن زوآنتید رشد می کند در شرحهای اولیه سعی تشخیص داده شد و دانشمندانی که با آن ارگانیسم کار می کردند بیمار شدند وعلائم شبیه آنفلونزا در طی مرحله جمع آوری وکارهای بعدی دیده شد.دیگر ترکیبات مانند میکا لامبد وآپلی سیاتوکسین بی نهایت مشکل ساز بودند آپلی سیاتوکسین همچنین دارای ویژگیهای قوی توسعه دهنده توموری است. به طور کل هنگام کار با هر ارگانیسم جدید ایمن تر آناست که فرض کنیم مقدار دقیق ترکیبات آبزی باید احتیاط و دقت کافی مبذول شود . وسیله محافظی مناسب ماننذ دستکش و یاحفاظ چشم بایدهمیشه استفاده شود. بسیاری از محققان ( مانند خود مؤلف) مواردی از ناراحتی شدید چشم داشته اندکه در کلی جمع آوری ارگانیسم ها به وجود آمده بود این در حالی بود که هیدروژنها واسفنج هایی مانند : Tedania   ignis    , VeoF : bularia  heitangere دارای مؤلفه های آزار دهنده زیادی هستند که باعث خارش و تشکیل دانه در بعضی افراد می گردند. به طور نمونه یک رویارویی با اسفنج NEOF : bularia  به تنهایی می تواند محققانی را که در آزمایشگاه مؤلف کار می کنند بر آن دارد تا همگام کار یا نمونه ها از دستکش استفاده کنند . قویاً توصیه می شود که هنگام شنا و استفاده از لوله مخصوص تنفس یرای ارگانیسم ها از دستکش مناسب استفاده شود. اینجا می تواند از یک لباس مرطوب ( یا پوست غواصی ) و یا دستکش استفاده نمود ماسک های غواصی می توانند حافظ شخص باشند وشیشه های ایمنی ویا عینک های آفتابی می توانند حافظ شخص باشند برای کار در آزمایشگاه و جهت استفاده از ترکیباتی با خواص بیولوژیکی مجهول  باید از اصول استاندارد تبعیت کرد . باید مراقب باشید که در معرض  مستقیم ترکیبات قرار نگیرید هنگام ضرورت دستکش بپوشید ، با استفاده از هودهای شیمیایی کار کنید از تماس ترکیبات با پوست جلوگیری کنید ، از نمونه ها قورت ندهید و آنها را به طور مستقیم بو نکنید . اگر به دلایلی نمونه را باید بو کنید (‌مؤلف توصیه می کند که این کار را نکنید) از موارد احتیاطی شیمیایی طبیعی استفاده کنید وبخار را در جهت بینی خود به حرکت در آورید تا از مقدار آسیب کاسته شود.

اگر عصاره ها ، اجزاء و یا ترکیبات خالص بر زمین می ریزند باید بلافاصله آنجا را پاک کنید در غیر این صورت ممکن است دیگر افراد در معرض آن ترکیب قرار بگیرند .حتی یک قطره کوچک یک ترکیب مانند میکلامید (  Myclamideya ) یک ماده ای است که بی نهایت آزار دهنده است . باعث تورم فوری پوست می گردد ، می تواند در صورت تماس با پوست بی نهایت مشکل ساز باشد . اثرات بلند مدت رویارویی با اینترکیبات مانند پیدایش تومور و تراتوژیستی در بسیاری از این ترکیبات  ثابت نشده اند. بنابراین باید از روارویی با آنهاجلوگیری کنید. به طور خلاصه تمام نمونه ها و عصارههای آبزی را با احتیاط یررسی کنید از وسایل پوششی مناسب استفاده کنید در معرض مستقیممواد قرار نگیرید . این امر در مورد ارگانیسم خام وعصاره ها و اجزای حاصل از آنهاصادق است.

2-2 :جمع آوری :

فلسفه های متفاوتی در مورد این نکته وجود دارد که کدام ارگانیسم جالبترین ماده شیمیایی تولیدات طبیعی آبزی را به دست می دهد و بسیاری از گروههای دخیل در غربال مقیاسی بزرگ عصاره های آبزی جهت کشف داروها فراوان جمع آوری می شوند تا بتوان بالاترینتنوع شیمیایی را برای آزمایش در آنزیم ویژه و یا سنجش های  زیستی مبنای گیرند. پیوندی به دست آورد دیگر گروههایی که وجود دارند زمینه مواد شیمیایی محصولات طبیعی گروههای خاص که غنی از محصولات طبیعی هستند تخصص دارند . هنوز گروههای دیگری هستند که به ارگانیسم هایی توجه دارند که در انها یک دلیل اکولوژیکی برای تولید ترکیبات یافت می شود . اسفنج ها ویا نرم تنان پوشش دار یا سطوحی آزاد ارگانیسم های رسوب کننده می توانند ترکیباتی تولید کنند که از رسوب ممانعت به عمل می آورند ارگانیسم هایی با روکش و پوشش نازک اغلب غنی از متابولیست های ثانویه می باشند وپیشنهاد شده است که این ترکیبات برای مهار رشد ارگانیسم های مجاور تولید می شوند و بدین ترتیب به ارگانیسم هایی پوششش دار وboring  اجازه می دهند که در فضای اضافی  و بیشتری کولونی بدهند .ارگانیسم هایی که در مناطق گیاهخوار ویا شکار وجود دارند اغلب ترکیبات سعی و یاغیر خوراکی تولید می کنند که برای جلوگیری از شکار می باشند . در نهایت انتخاب ارگانیسم جهت جمع آوری به سطح تجربه و اولویت جمع کننده و هدف نهایی برنامه تحقیق بستگی دارد .

جمع آوری ارگانیسم ها باید به دقت انجام شود ونکات مربوط به عرض جفرافیایی  ، طول جغرافیایی ، عمق ، جریان، امواج ، دمای آب ،‌میزان شوری وتاریخ جمع آوری باید ثبت شوند.نکات مربوط به زیستگاه . مجوعه ( مانند تپه های دریایی ) حفرات ،‌زیر سنگ ها ، در جانب انتهایی صخره ها ،که بر سطوح و جلویی سنگ ها و یا بر سطح دیگر ارگانیسم ها ) و هر بر هم کنش مشاهده شد با دیگر ارگانیسم ها (‌که با برهنه آبشش تغذیه می شوند.) با سیانوفیت ها رشد  می کنند ، در حاشیه ها به علت ارگانیسم مجاور  می میرند) باید ثبت شوند . توصیفات دقیق ارگانیسم ها مانند رنگ ، ریخت ، سازگاری ، وجود معکوس ، بود وحالت تولید مثل ، باید در صورت آشکار شدن ثبت شوند . عکس Insitu  ,  deckside  برای ارزیابی بعدی در امر طبقه بندی مهم است . وجود ارگانیسم های مربوطه در داخل و خارج باید مورد توجه قرار می گیرد. اغلب رایجاست کرم ها ، جانوران نرم تن ، پاروپایان ، ستاره های کننده ، شقایق های نعصانی ، و حتی ماهی های کوچکی که در بی مهرگان بزرگ دریایی زندگی کشف شوند . اپیفیت ها . زوآنتید ها تا حد زیادی در رابطه با بی مهرگان کم تجربه نمی توانند بر مواد شیمیایی موجود اثر بگذارند . در بسیاری از موارد جمع آوری کنندگان کم تجربه نمی توانند تمام ارگانیسم های مربوطه راشناسایی کنند بلکه یادداشت های تفصیلی میدانی و شواهد آماده شده دقیق می توانند به فرد طبقه یندی کننده با تجربه و بیولویست میدانی کمک کندد تا در امر شناسایی ارگانیسم های مربوطه های بعدی موفق گردند.

نمونه های شواهدی باید برای تکمیل شناسایی گردآوری شوند.این شواهد برای مستند کردن یک اختراع در صورت بایگانی یک ثبت اختراع لازم هستند این نمونه ها باید نمایشگر کل نمونه باشند اگر رنگ و یا شکل های متفاوت یک نمونه جمع آوری شوند شواهد هر یک باید نگهداری شوند. اگر نمونه ها کوچک هستند یک نمونه کاملی در صورت امکان باید حفظ شود در آزمایشگاهها نمونه های با  40ml  تا 100  پارچ متناسب هستند واین به شکل نمونه بستگی دارد. به طور نمونه ، اسفنج ها یابرش یک قطعه ای که ساختار درونی وبرونی و شکل کلی ارگانیسم را نشان می دهد به شکل یک نوع شواهد در می آیند. اسیپکول هایی که در شناسایی بیشتر خانواده های اسفنج ها مهم هستند. می توانند در یک محل گرد آیند و مشخص شوند و لازم است که مقام بخشهای اسفنج به صورت یک نمونه در آیند. به علاوه یک نمونه واحد می تواند یک اجتماعی باشد که در آن یک اسفنج در سطح دوم قرار می گیرد . یک مثال اسفنج  Myriastra  kalitetilla , carribbean  می باشد که به شکل یک اسفنج شیار دار کروی بایک بخش خارجی نارنجی مایل به قرمز و یک بخش درونی کرم رنگ یافت می شود. سطح قرمز به علت تجمع پوسته   خیلی نازک توسط یک Desmacella  SP می باشد. استخراج لایه سطح قرمز یک دنباله متفاوتی از ترکیبات تولید می کند و با استخراج بخش درونی کرم رنگ اسفنج نمونه های اسفنجی معمولاً در اتنول آبی 70 % ذخیره می شوند ( 30ml  آب در هر 70 لیتر اتانول 100 % ) . Octocoral ها و مرجان های سخت می توانند همانند اسفنج ها به صورت یک نمونه در آیند.

نرم تنان پوشش دار و ارگانیسم های نرم تن دیگر مانند آلوسیوناسیان ها ، شقیق نعمانی ، حلقویان و بعضی از ستاره های شکننده ) سخت تر نهداری می شوند . این ارگانیسم ها قبل از نگهداری بلند مدتدر حالت رخوت و آرامش قرار می گیرند . و به این ترتیب بعد از نگهداری روز باز باقی می مانند این عملکرد با قرار داد نمونه در آب دریا که دارای چند بلور متانول است انجام می شود. این نمونه بعد از آن در یک یخچال به طور 24 ساعته ذخیره می شود . ( در صورت امکان ) و بعد آب دریا به آهستگی ریخته می شود . نرم تنان پوشش دار به طور دائم در محلول فورمالین 10 % ذخیره می شوند . این محلول باتر دقیق محلول فرومالید استحکام کامل ( 37 %) به دست می آید ( 1ML محلول فرمالئد در هر 9ML آب ) در حالی که دیگر بی مهرگان نرم تن ( آلسوناسیان ها ، شقایق یمانی ، ستاره های شکننده ) می توانند برای همیشه در اتانول 70 % نگهداری شوند. نرم تنان کولونی می توانند به سختی شناسایی شوند زیرا به سختی نگهداری می گردند . ارزش آن را دارد که به مراحل دقیق نگهداری مستقیماً از سوی متخصص طبقه بندی که نمونه ها را شناسایی خواهد کرد دست یابیم . ژله ماهی ها و بسیاری از خارپوستان بعد از رخوت با متانول در محلول فرمالین 10 % نگهداری شوند. این ها در اغلب شکل خود را به سرعت از دست می دهند و بنابراین سند تصویری می تواند مهم باشد جلبکها به عنوان نمونه های خشک شده با فشار ذخیره نگهداری می شوند ولی می توانند در محلول فرمالین 5 % نیز ذخیره شوند. اگر یک نفر تصمیم بگیرد که نمونه ها را به آزمایشگاهی داخل یک هواپیمای تجاری برگرداند حمل و نقل مقادیر با اتانول مجاز نمی باشد. در این موارد نمونه ها می توانند در فرمالین 10 % ذخیره شوند. ( هر چیزی به جزء جلبک ها ) و یا در فرمالین 5 % حفظ می شوند  تا  این که به آزمایشگاه برگردانده شوند. در آزمایشگاه ما ، وقتی سفر هوایی مورد نیاز باشد نمونه ها در کیسه نمونه Whipak قرار می گیرند ؛ محلول 0 % فرمالین . اینها بعد از آن برای حمل و نقل در قوطی های حمل و نقل خشک قرار داده می شوند. آنها به محض برگشت به آزمایشگاه می توانند برای ذخیره طولانی به محل نگهداری مناسب منتقل شوند. مقام مجوعه های ارگانیسم آبزی همانند تمام نمونه هایی که برای تحقیق پیرامون محصولات طبیعی جمع آوری می شوند باید با رضایت ایالت و یا کشور میزبان ساخته شوند . اجازه برای بیشتر جمع آوریهای ارگانیسم های آبزی الزامی است و باید تحت قوانین فدرال و یا داخلی باشد. بعضی از گونه های آبزی توسط ClIES حفظ شوند و نمی توانند بدون اجازه ویژه جمع آوری شده صادر شوند . یک بررسی توسط باکر و دیگران بیانگر فلسفه های کلی و خط مشی های لازم باتوجه به جمع آوری ارگانیسم های آبزی و خاکی می باشد.

3-2 : ذخیره ارگانیسم های آبزی :

ارگانیسم های آبزی اغلب در محل های متروکی جمع آوری می شوند که تسهیلات آزمایشگاهی محدودی دارند . بسیاری بلافاصله در رویایی با هوا می میمرند و به سرعت تجزیه می شوند. ترکیبات یافت شده در ارگانیسم ها می توانند به سرعت با فرآیندهای اکسیداسیون ، آنزیمی و یا پلیمریزاسیون تجزیه شوند بنابراین ارگانیسم ها باید بلافاصله خشک شوند و یا منجمد گردند تا تخریب شیمیایی کاهش یابد. ترکیبات موجود در بعضی ارگانیسم هامانند  اسفنج های Verongid می توانند بلافاصله هنگام لمس تخریب شوند و پلیمر می کردند. این با تغییر رنگ سریع از سفید و زرد  و یا نارنجی به آبی تیره قابل مشاهده است حتی وقتی که آنها در آب دریا حفظ شوند.

بسیاری از گروههای ارگانیسم ها را بلافاصله بعداز جمع آوری در –20c منجمد می کنند و آنها را درحالت انجماد نگه می دارند تا این که عملکرد بیشتر انجام شود. در بعضی واردارگانیسم ها در یک الکل قرار می گیرند مانند متانول ، اتانول و یا ایزوپروپانول . بعد از آن ارگانیسم حفظ شده در دمای اتاق و یا در یک فریزر نگهداری می شود. بعضی از ارگانیسم ها و جلبک ها اغلب در معرض هوا خشک می شوند و سپس در دمای اتاق ویا در فریزر ذخیره می شوند. تا اقدامات بعدی صورت گیرد . آگر تسهیلات موجود دردسترس باشند نمونه ها می توانند بلافاصله بعد از جمع آوری خشک فریز گردند وسپس در دمایی اتاق و یافریزر ذخیره شوند .یک گروه که در آزمایشگاه میدانی با تسهیلات  محدود کار می کرد ارگانیسم را به مدت 24 ساعت در ETOH-H2O / 50 –50 فرو برد. این محلول بعد از آن قارچ شد . ارگانیسم ها در پلیمرهای Nalgene قرار گرفتند و به آزمایشگاه وطن برگردانده شده ودر دمای محیط قرار گرفتند.

در گروه ما ، ارگانیسم ها به صورت تصویری مستند شدند ، یک نمونه طبقاتی گرفته شده ، یک زیر نمونه برای استخراج انتخاب شد و نکات مربوط به جمع آوری و طبقه بندی ثبت شدند وسپس مابقی نمونه جهت کار بیشتر 20- درجه سانتیگراد منجمد شد. تلاش های زیادی صورت گرفت تا نمونه در عرض 1 ساعت جمع آوری در فریزر قرار گیرد . اینکار برای کاهش تخریب ترکیبات بوده است . وقتی چنین چیزی عملی نباشد نمونه ها  ذخیره می شوند تا آزمایش کامل گردد .

3- استخراج

1-3 : بی مهرگان :‌

یکطرح استخراجی نمونه برای بی مهرگان آبزی ( منجمد ،‌خشک و یا خشک فریز ) : بی مهرگان به قطعات کوچکی برش داده می شوند و در یک مخلوط کن با سرعت زیاد با حلال مخلوط می گردند. عصاره های حاصل از هر طریق کاغذ صافی شماره 1 واتن ( جاذبه و یا خلاء ) ویا بستری از  Celite 521 بسته بندی شده و در یک قیف Buchner تصفیه می شوند. بعد از تصفیه مابقی بافت به مخلوط کن برمی گردد وبا یک بخش دوم حلال استخراج می شود . این فرآیند ادامه می یابد تا اینکه هیچ رنگ دیگری استخراج نشود . در حالاتی که عصاره ها بی رنگ گردند . عصاره های متوالی می توانند به طور جداگانه تلغیظ شوند و جرم باقی ماند. بعداز تلغیظ تعیین می شود. استخراج می تواند زمانی کامل در نظر گرفته شود که هیچ باقی ماند ؟ اضافی دیگری بعد از تلغیظ به دست نیاید. هنگام دنبال کردن خالص سازی زیستی ، عصاره های متوالی می توانند به طور جداگانه تلغیظ شده و سنجش شوند. در آزمایشگاه ها نمونه ها 3 تا 6 بار استخراج می شوند تا استخراج کامل تضمین گردد .

بعضی از آزمایشگاه ها عصاره های متوالی هر ارگانیسم را با استفاده از حلال هایی باقطبیت بالا آماده می کنند. در این جا مقیاس جداسازی مقدماتی مؤلفه ها مورد نیاز است .ارگانیسم ها ابتدا با یک حلال  غیر قطبی استخراج می شوند مانند دی اتیل اتر ، هگزان ،‌اتیل استات ، و یا یک حلال هالوژنه (‌دی کلرو متان، کلروفرم) سپس با یک الکل (‌متانول و یا اتانول )‌وبعد با آب و مخلوطهای آب الکل استخراج می گردند. بعضی ها گروهها از استون برای استخراج استفادهمی کنند ولی باید مراقب بود که محصول افزایشی تشکیل نشود.