مقدمه
خون بافتی است که از 2 قسمت سلول ها و مایع تشکیل شده است. سلول ها عبارتند از گلبول های قرمز داریتروسیت ها، گلبول های سفید (کلوسیت ها) و پلاکت ها مایع خون را پلاسما گویند که حدوداً از 90 درصد آب و 10 درصد مواد جامد محلول در آن تشکیل شده است.
پلاسما شامل مواد پروتئینی، الکترولیت ها (مانند سدیم، پتاسیم، کلسیم، بیکربنات و …) قند، کلسترول، اسیدهای چرب، فسفولیپید ها، آنزیم ها و غیره می باشند.
اعمال مختلف خون در بدن عبارتند از:
1- حمل اکسیژن به بافت ها و خارج کردن دی اکسید کربن از آنها
2- حمل مواد غذایی به بافت ها
3- انتقال فرآورده های متابولیسمی برای دفع به کلیه ها، کبد، ریه، روده، پوست
4- تنظیم آب داخل و خارج سلولی
5- تنظیم حرارت بدن با انتشار خون در بافت ها
6- توزیع هورمون ها و سایر مواد
7- دفاع بدن و ایجاد ایمنی
خون به عنوان یک بافت با اعمال فوق دارای ویژگی هایی است که آن را از سایر بافتها متمایز کند. هنگامی که خون کامل دارای ماده ضد انعقاد سانتریفوژ می شود، فضایی که به وسیله گلبول های قرمز فشرده شده اشغال می شود، اصطلاحاً هماتوکریت نام دارد و به صورت درصد گلبول های قرمز خون نسبت به خون کامل بیان می شود.
به عبارت دیگر هماتوکریت یک نمونه خون، نسبت حجم گلبول های قرمز به حجم کل خون است .
همچنین هماتوکریت به عنوان PCV یا حجم گلبول های قرمز فشرده شده شناخته شده است مقادیر هماتوکریت کاملاً به موازات مقادیر و تعداد گلبولهای قرمز خون است. مقادیر نرمال هماتوکریت همانند هموگلوبین و تعداد گلبول های قرمز خون تحت تأثیر عوامل مختلفی مانند سن، جنس، نژاد و محیط و … قرار می گیرد.
روش های خون گیری از ماهی:
2 روش کلی خون گیری در ماهیان است:
1) روش خون گیری مکرر از یک ماهی Serial Blood Sampliny
2) فقط یک بار خون گیری Once Only Sampling
روش خون گیری مکرر به دلیل استرس ناشی از خون گیری کمتر استفاده می شود لذا محققان روش فقط یک بار خون گیری را توصیه می کنند.
زمانی که زنده بودن ماهی پس از خون گیری مهم نباشد می توان ماهی را کشت به 3 طریق:
1- یک ضربه محکم و سریع را با استفاده از یک شی فلزی دسته اسکالپر، به ناحیه اتصال جمجمه و ستون مهره ها در ناحیه سر وارد کنیم. در این حالت نخاع قطع شده و منجر به مرگ می شود.
2- نخاع را قطع کنیم و با فرو کردن و حرکت جانبی تیغه اسکالپر در محل اتصال جمجمه به اولین مهره ستون فقرات در ناحیه سر با یک حرکت افقی
3- استفاده از مواد بیهوش کننده با غلظت بیش از غلظت لازم برای بیهوشی
در صورتی که بخواهیم ماهی زنده بماند پودر Ms 222 را به نسبت خاص برای ماهی مورد نظر حل کرده ماهی ها را یکی یکی درون محلول گذاشته و پس از 2 دقیقه بیهوش می شوند ماهی را خشک کرده از پهلو روی میز گذاشته از بالای ساقه دمی باز اولیه 45 درجه در کنار خط جانبی وارد عضله شده وقتی سرنگ به ستون مهره جاندار رسید با بازی در آن به رگ های این قسمت رسیده و با کشیدن پیستون سرنگ مقدار خون مورد نیاز به دست می آید.
یا از انتهای باله مخرجی در قسمت ساقه دمی و از قسمت شکمی ماهی به صورت عمودی سوزن را وارد عضله ماهی کرده و وقتی بر ستون مهره رسید (به شبکه رگ های این قسمت) با کشیدن پیستون سرنگ ؟؟؟ تأمین می شود (جمالزاده، 1380)
از نواحی مختلف می توان خون گیری کرد:
- قطع ساقه دهی در ماهی کوچک
- در ماهیان بزرگ تر خون را می توان با استفاده از آئورت پشتی یا Dosal aortic puncture آئورت شکمی –قلب به دست می آید.
زمانی که ماهی ما ارزش داشته باشد و زنده ماندن آن مهم باشد و ولش لوله گذاری Canultion مطرح است که مانند قرار دادن یک 3 راهی لوله ای نازک در وسط جریان خون است. که برای ماهیان بزرگ تر استفاده شود. سر لوله گره زده می شود و هر وقت نیاز باشد خون از این منطقه برداشته می شود. (محل قرارگیری 3 راهی لوله ای نازک کمان آبششی رگ های آوران – وابران است)
بهترین نتایج از تلفیق روش های کشتن ماهی Stunning به همراه استفاده از ماده ضد انعقاد مپارین و نگه داری نمونه خون گرفته شده در سرما و سرعت عمل در انجام مراحل حاصل می شود.
مواد و روش کار:
ماهی از خانواده Cyprinidae (کپور-ماهی حوض)
قیچی
خط کش خواندن هماتوکریت
سانترینوژ هماتوکریت
خمیر هماتوکریت (موم) Cristoseal
لوله هماتوکریت
هماتوکریت را ممکن است مستقیماً به وسیله سانتریفوژ و به روش های ماکرو یا Wintrobe و نیتروب و میکروهماتوکریت اندازه گیری کنند یا به صورت غیر مستقیم توسط دستگاه های اتوماتیک و از حاصل ضرب MCV در شمارش گلبول های قرمز به دست آورند.
روش و نیتروب در گذشته استفاده زیادی داشت ولی امروزه به علت زیاد بودن خون مورد نیاز، مدت زمان طولانی سانتریفوژ و زیاد بودن پلاسمای به دام افتاده در لابه لای گلبول های قرمز کاربرد کمی دارد.
روش میکروهماتوکریت Microhatocrit
در این روش از لوله های میکروهماتوکریت با طول تقریباً 7 سانتی متر و قلمرو یک میلی متر استفاده شود در انتهای لوله های میکروهماتوکریت یک حلقه رنگی وجود دارد. در لوله های میکروهماتوکریت فاقد ضد انعقاد، حلقه آبی و رنگ و در لوله های میکروهماتوکریت آغشته به ماده ضد انعقاد هپارین، حلقه قرمز رنگ یافت می شود. لوله های اخیر را با هپارین که به نسبت یک به 1000 رقیق شده است پر کرده و سپس در حرارت 56 تا 37 درجه سانتی گراد خشک می کنند اگر از خون دارای ماده ضد انعقاد استفاده می شد باید لوله های آبی رنگ استفاده شود ولی چنانچه از خون مویرگی استفاده می شود از لوله های میکروهماتوکریت با حلقه قرمز رنگ استفاده شود.
سانتریفوژ میکروهماتوکریت دارای حوزه سانتریفوژی 10000 تا 15000 است که پس از روشن شدن در عرض 3 ثانیه به حداکثر سرعت می رسد.
در روش میکرو، لوله های مو ئینه مدرج نیستند در این روش باید ارتفاع ستون خون را که شامل پلاسما گلبول های قرمز است با خط کش میلی متری مخصوص یا صفحه مدرج مخصوص میکروهماتوکریت، قرائت کرد.
اینجا *
1- ماهی را قطع ساقه دمی کرده لوله هپارینه را در تماس با خون قرار می دهیم لوله میکروهماتوکریت را به طوری که حباب مواد ایجاد نشود پر می کنیم.
2- انتهای خشک لوله میکروهماتوکریت را در وضعیت عمودی در خمیر هماتوکریت فرو کرده تا در حدود 6-4 میلی متر از انتهای لوله از خمیر پر شود. در حین عمل نباید به خون موجود در لوله فشار وارد شود.
3- دو لوله هماتوکریت را در شیارهای شعاعی سانتریفوژ، به طوری که در وضعیت مخالف و روبروی یکدیگر باشند قرار داده انتهای بسته لوله ها باید به طرف خارج صفحه سانتریفوژ قرار داشته باشد.
4- به مدت 5 دقیقه دستگاه را به کار بیاندازید با استاندارد 7000 rpm
5- به محض اینکه سانتریفوژ متوقف شد لوله های میکروهماتوکریت را از آن خارج کرده و با استفاده از خط کش یا جدول مدرج مخصوص، هماتوکریت را برحسب درصد قرائت می نمائیم اختلاف 2 لوله هماتوکریت باید در حدود درصد باشد در غیر این صورت باید آزمایش تکرار شود. (عامری 1378)
نتایج:
هنگامی که خون کاملاً سانتریفوژ می شود گلبول های قرمز به علت وزن مخصوص زیادتری که نسبت به سایر عناصر خونی دارند در ته لوله قرار می گیرند به طوری که به ترتیب از سر لوله به پایین طبقاتی به شرح زیر ایجاد می شود:
1- پلاسما: طبقه زرد رنگ
2- لایه بافی کوت (Buffy coot): طبقه خاکستری مایل به قرمز شامل:
الف- ترمبوسیت ها: طبقه رویی به رنگ کرم
ب- مکوسیت ها: طبقه خاکستری قرمز رنگ
ج- گلبول های قرمز هسته دار که در لایه بافی کوت در صورت وجود ایجاد رنگ قرمز می کنند.
3- طبقه گلبول های قرمز
(عامری 1378)
برای خواندن میزان هماتوکریت ها با خط کش هماتوکریت: لوله هماتوکریت را در شیار خط کش هماتوکریت قرار داده و انتهای پایین ستون گلبول های قرمز را با خط صفر تنظیم کرده سپس خط سفید متحرک میانی را با سطح بالای گلبولهای قرمز تنظیم و درصد حجم گلبولهای قرمز را از روی ستون مندرج می خوانیم. میزان Hc+ در ماهیان بالغ بیشتر از نابالغ است. (جمالزاده 1380)
این در آزمایش هماتوکریت به ترتیب زیر است:
(1979) Smeda , Hooston . (1979) Millich 8 Catlett
در مطالعات حجم خون پلاسما را 8/2 و 3 درصد محاسبه نموده اند. حجم خون ماهیان نسبت به سایر مهره داران کمتر است. در ماهیان اسلاموبرانش این میزان بین 6-8 میلی بیتر به ازاء 100 گرم و در استخوانی بین 2-4 میلی لیتر به ازاء 100 گرم است.
میزان هماتوکریت را با درصد نشان می دهند. معمولاً در ماهیان اسلاموبرانش (آبشش صفحه ای ها) میزان هماتوکریت کمتر از 25 درصد است.
در ماهیان استخوانی این میزان بین 10 تا 30 درصد متغیر است.
در کپور معمولی حدود 27 درصد است.
درماهیان دریایی فعال مثل تن ماهیان یا Thunnus بالاترین میزان هماتوکریت که حدوداً بیش از 50 درصد است مشاهده شده است. (هماتوکریت انسانی 45 درصد).
میزان هماتوکریت و به تبع آن هموگلوبین با توجه به عواملی چون گونه، فصل، دما، وضعیت تغذیه و بهداشت ماهی متفاوت است در برخی گونه های وجود تغییرات شبانه روزی هم گزارش شده است.
یکی از عوامل تغییر هماتوکریت ماهیان تنظیم فشار اسمزی است. در صورت عدم تنظیم فشار اسمزی در ماهیان آب شیرین به دلیل ورود بیش از حد آب به بدن خون این ماهیان رقیق شده و همودیلیشن از آب شیرین به شور بالا می رود. و Hct کاهش می یابد.
در ماهیان آب شور به دلیل خروج آب از بدن خون غلیظ شده و Hemoconcentration و Hct و هماتوکریت، آن بیشتر می شود به نظر می رسد Hct ماهیان دریایی از این نظر بیش از ماهیان آب شیرین است.
بحث:
1- سرعت و مدت کافی برای سانتریفوژ کردن شروط اساسی در به دست آوردن یک هماتوکریت صحیح است گلبول های قرمز توسط سانتریفوژ کردن باید آنقدر فشرده شوند که با سانتریفوژ کردن بیشتر حجم گلبول های قرمز متراکم، کاهش پیدا نکند.
2- اگر انتهای لوله های میکروهماتوکریت به طور ناقص بسته شود باعث کاهش کاذب نتایج خواهد شد.
3- عدم سانتریفوژ کافی و همچنین ماندن لوله ها به مدت بیشتر از 10 دقیقه پس از اینکه سانتریفوژ متوقف شد باعث افزایش کاذب نتایج خواهد شد.
4- اگر مقدار ماده ضد انعقاد بیش از حد نیاز باشد به علت چروکیده شدن گلبول های قرمز خون باعث کاهی کاذب خواهد شد.
5- در حین عمل سانتریفوژ کردن، بخش کوچکی از گلبول های سفید، پلاکت ها و پلاسما در میان گلبول های قرمز به دام می افتند که خطای ناشی از آن اهمیت چندانی ندارد. افزایش هماتوکریت حامل از پلاسمای به دام افتاده (Trapped Plasma) گاهی بیشتر از هماتوکریت حاصل از گلبول های سفید و پلاکتهای به دام افتاده است کاهش نیروی سانتریفوژ باعث افزایش مقدار پلاسمای به دام افتاده در میان گلبولهای قرمز می شود و همچنین مقدار آن در روش هاکر و بیش از میکرو است. در روش میکرو هماتوکریت، پلاسمای به دام افتاده حدود یک تا 3 درصد کل ستون گلبول های قرمز متراکم می باشد.
6- به علت کمتر بودن زمان سانتریفوژ و نیز خطای ناشی از پلاسمای به دام افتاده روش میکرو هماتوکریت بر روش ماکرو ارجحیت دارد و به عنوان روش مرجع توسط کیته بین المللی استاندارد کردن هماتولوژی (ICSH) توصیه شده است. میزان خطای این روش 2-1 درصد است.
7- برای به دست آوردن نتایج صحیح نمونه ها باید در سرما نگهداری شوند.
8- در هنگام قرائت Hc+ باید بالاترین حد لایه گلبول های قرمز خوانده شود این مطلب زمانی که تعداد گلبول های سفید یا پلاکت ها افزایش شدید دارد دارای اهمیت فراوان است. (عامری 1378)
9- مقدار هماتوکریت به اندازه تعداد گلبولهای سرخ و همچنین حجم پلاسما بستگی دارد اگر مقدار آن بیش از اندازه طبیعی باشد می تواند نمودار افزایش گویچه ها یا کاهش حجم پلاسما باشد.
- اگر مقدار هماتوکریت کمتر از حد طبیعی باشد ممکن است به دلیل کاهش تعداد گویچه های قرمز یا افزایش حجم پلاسما باشد (کم خونی- انسانی)
10- از آنجایی که هموگلوبین معمولاً حجم گلبول قرمز را اشغال می کند میتوان با تقسیم کردن PCV بر عدد 3 مقدار تقریبی Hd را برحسب گرم در دسی لیتر به دست آمد. و با توجه به اینکه PCV بستگی کامل به اندازه و مقدار گلبولهای قرمز موجود در واحد خون دارد می توان از تقسیم کردن PCV به عدد 6 مقدار تقریبی گلبول های قرمز را در یک میلی مترمکعب خون بر حسب میلیون به دست آورد. (عامری 1378)
تهیه گسترش خون (Blood Smear Preparation)
بررسی گسترش خونی بخش مهمی از ارزیابی هماتولوژی را تشکیل می دهد. قابل اعتماد بودن اطلاعات به دست آمده از بررسی گسترش خونی، بستگی زیاد به تهیه و رنگ آمیزی خوب گسترش ها دارد.
در اینجا سه روش برای تهیه گسترش های خون شرح داده می شود که عبارتند از: روش گسترش روی لام ( Slide Film) یا روش دو لامی یا روش گوه ای (The two slide or wedge method) روش گسترش روی لامل (Cover glass method) و روش خودکار یا چرخشی (Spinner method).
دو روش اضافه بر روش های فوق برای تهیه‌گسترش های خون در برخی موارد مورد استفاده قرار می گیرند. یکی از این موارد تهیه گسترش از لایه بافی کوت (Buffy coat) در لوله های میکروهماتوکریت است و هنگامی مورد استفاده قرار می گیرد که تعداد گلبول های سفید خون به شدت کاهش یافته است و این روش باعث تغلیظ سلول های هسته دار خون می گردد. روش دیگر تهیه گسترش ضخیم خون (Thick blood smear) است که معمولاً برای جستجوی انگل های خونی انجام می شود.