تحقیق مقاله نقش کشت بافت در توسعه تحقیقات برنج

نقش کشت بافت در توسعه تحقیقات برنج

- باززایی گیاهان

هنگامی که پینه‌های مشتق از پروتوپلاست به بزرگی 2 میلی‌متر رسیدند، در یک محیط غذایی باززایی کشت می‌شوند. معمولاً از محیط غذایی N6 بدون تنظیم کننده رشد یا با سیتوکنین (یک میلی‌گرم بر لیتر کینیتن) به عنوان محیط غذایی باززایی استفاده می‌شود (جدول 2-3). عبداله و همکاران (1986) ثابت کردند که محیط غذایی N6 به دلیل این که غلظت آمونیوم آن در مقایسه با MS پایین‌تر است برای باززایی مناسب‌تر می‌باشد. عموماً  باززایی گیاهی در برنج از راه اندام زایی وقوع می‌یابد. با این حال، وجود گزارش‌های اندکی حاکی از این است که گیاهان می‌توانند از راه رویان زایی بدنی نیز حاصل شوند (عبداله و همکاران، 1986، کیوزوکا و همکاران، 1987).

معمولاسرعت باززایی گیاهچه‌ها20-10% است. این سرعت نه تنها به شرایط کشت در محیط باززایی بلکه به پروره‌ها، منابع و تعداد واکشت‌های لاین‌‌های یاخته‌ای مورد استفاده در جداسازی پروتوپلاست ‌ها بستگی دارد. بالاترین سرعت باززایی در نیپون بار و یاماهوشی گزارش شده است. این دو پروره در دودمانه به یکدیگر وابسته هستند. هر دوی آن‌ها دارای قابلیت باززایی بالایی در کشت بساکند (ساساکی 1986). ساسانیشی‌کی وکوشی هیکاری نیز برای کشت پروتوپلاست استفاده شدند. عموماً هنگامی که زیرکشت‌های منشاء از یاخته‌های مرسیتمی جوان نظیر رویان‌های نارس، خوشه‌های جوان و بساک‌ها انتخاب شوند، دارای سرعت باززایی بالا خواهند بود. علاوه بر این، وقتی که پروتوپلاست‌‌ها از پینه‌ای که برای مدت طولانی واکشت شده‌اند جدا شوند، سرعت باززایی زیاد خواهد بود. پینه تازه به اندازه یک سال پس از آغاز کشت، برای کشت پروتوپلاست پیشنهاد می‌شود.

اوگورا و همکاران (1987) از پروتوپلاست تعداد زیادی گیاه باززایی کردند. بسیاری از گیاهان باززایی در مقایسه با شاهد تمایل به تولید پنجه‌ها و خوشه‌ها و میزان محصول بیش‌ترند. با وجود این، طول ساقه، تعداد دانه در خوشه و باروری دانه‌ها به پایین تمایل داشتند. هشت درصد گیاهان باززایی شده‌یک دسته ازکروموزوم‌های دولاد عادی را داشتند. از طرف دیگر، در حالتی که توری‌یاما و همکاران (1986) از کشت پروتوپلاست پینه‌ها که از دانه‌های گرده‌ی بساک‌ها منشا یافته بودند، گیاهانی را باززایی کردند که 33% آن‌ها تک لاد و 39% دولاد بارور، و بقیه با صفات ریخت شناختی ناهنجار، عقیم بودند.

باززایی گیاه از طریق کشت پروتوپلاست سازگانی مرکب از چندین مرحله است. هر مرحله بایستی متناسب و با دقت و بطور کامل انجام شود. حتی یک خطای کوچکی در یک مرحله ممکن است باعث شکست کامل شود. از این‌رو، از ایجاد خط یاخته‌ای آغازین تا مرحله باززایی گیاه بایستی در کشت دقت زیادی مبذول داشت.

اطلاعات منعکس در جدول‌های 2-2 و 2-3 نتایج موفقیت آمیز حالت‌های اولیه هستند. پس از این، چند مطالعه دیگری نیز توسط گروه‌های تحقیقاتی مختلف گزارش شده است.سازگان کشت پروتوپلاست فن مهمّی است که تصور می‌شود برای توسعه زیست‌فن شناسی، بویژه همجوشی پروتوپلاست و انتقال ژن مورد استفاده قرار گیرد.   

کشت بافت عبارت است از کشت یاخته، بافت، پیش‌دش (protoplast) و اندام‌های گیاهی در شرایط گندزدایی شده و در محیط غذایی مصنوعی در داخل لوله آزمایش. اکنون این فناوری به عنوان یک روش پایه‌ای و یک ابزار محوری بسیار عالی در تکثیر و اصلاح نژاد گونه‌های گیاهی مهم اقتصادی موقعیت ویژه‌ای‌را کسب کرده است. کشت بافت گیاهی در کشاورزی و باغبانی نیز کاربردهای عملی فراوانی دارد. آزمایشگاه‌های ریزازدیادی سالیانه میلیون‌ها نهال درختان و گیاهان زینتی را تولید و به بازار عرضه می‌کنند. کشت انتهای شاخه یا مریستم به منظور تولید گیاهان عاری از ویروس به طور گسترده‌ای در حال اجراست. کشت بساک، تخمک و همجوشی پیش دش‌ها در به‌نژادی با کاهش مدت زمان لازم و افزایش کارایی انتخاب، سرعت عمل را زیاد کرده است و علاوه بر این روش خوبی در درک فرایندهای زادشناختی (Genetic)، تنکارشناختی (Physiology)، زیست شیمیایی و زیست شناسی مولکولی به شمار می‌رود. از طرف دیگر گیاهان تراریخت که از انتقال DNA خارجی به یاخته‌ها و پس‌از باززایی گیاهی حاصل می‌شوند، به سرعت در حال پیشرفت است و تأثیر این محصولات در سلامت انسان در کشورهای اروپایی و آمریکایی تردیدهایی را برانگیخته است.اگرچه دامنه‌ی چنین جنبش هایی به آسیا و آفریقا کشیده نشده است امّا به منزله‌ی هشداری برای همه‌ی ملل جهان تلقی می گردد. اهداف اصلی این تحقیق برمبنای تکوین گیاهان تراژنی مقاوم به حشرات، بیماری‌ها، خطر سرما و علف‌کش‌ها استواراست. همجوشی پیش‌دش‌ها (یاخته‌های فاقد دیواره) امکان تلاقی بین گونه‌ای را مقدور می‌سازد. این روش برای تلاقی‌های بین گونه‌ای اهلی و وحشی اهمیت زیادی دارد، زیرا اولاً نسل اول آن‌ها فاقد رویان تکامل یافته و غیر قابل رویشند و دوماً گونه‌های وحشی معمولاً دارای ژن‌های کنترل کننده مقاومت به آفات و بیماری‌ها و شرایط محیطی می‌باشند. علاوه بر این در بعضی از روش‌های انتقال ژن‌ و تهیه پیش‌دش‌ها یک مرحله‌ی ضروری بوده و دریچه‌ی تازه‌ای در اصلاح نژادی گیاهان زراعی گشوده است. جدول 1 روش‌های مختلف کشت بافت و کاربرد آن را نشان می‌دهد.
روش‌های کشت بافت مبتنی بر دو مرحله تمایز زدایی و تمایزیابی می‌باشد. یاخته‌ها، بافت‌ها و اندام‌های گیاهی در طی مرحله تمایز زدایی، توده‌های یاخته‌ای بی‌شکل و متراکمی به نام پینه را تولید می‌نمایند و سپس در شرایط غذایی و محیطی مناسب تمایز یافته و بافت‌های مختلفی را ایجاد نموده و گیاهان کاملی را به وجود می‌آورند. به همین دلیل کشت بافت در مسائل مربوط به رشد و تمایزیابی تحت شرایط باز تولیدی به آزمایش‌های گیاهی کمک گرانبهایی کرده است. کشت بافت در کشاورزی و باغبانی نه تنها به منظور تکثیر گیاهان بلکه اهداف مربوط به جذب مواد غذایی خاک، مقاومت به شوری خاک، حذف عوامل بیماری‌زا، حفظ ذخایر گیاهی ارزشمند در کشت‌ها و در درجه حرارت‌های پایین و اصلاح گیاهان کاربردهای عملی بسیار وسیعی پیدا کرده است. اهمیت کشت بافت گیاهی به اندازه‌ای است که بسیاری از دانشگاه‌های دنیا آن را در دوره‌های آموزشی پیشرفته و مقدماتی خود گنجانیده‌اند و حتی در بعضی از کشورها دوره‌های تخصصی ریزازدیادی را در سطح تولید سازماندهی کرده اند.
نظریه بس‌توانی (Totipotency) که در سال 1838 توسط شلیدین و شوآن پیشنهاد شد، نیروی محرکه‌ی اصلی توسعه‌ی این شاخه‌ی زی فن شناسی بوده است. بس توانی یاخته‌ای عبارت است از این که یاخته‌های گیاهی در وظایفشان خود سازند و در اصل استعداد باززایی و تولید گیاه کامل را در خود دارند. در ابتدا این نگره فقط در یاخته‌های تخم و هاگ تأیید شد. پس از گذشت مدت زمان طولانی برای یاخته‌ها‌ی بدنی نیز به اثبات رسید. بنابراین، بس‌توانی به عنوان یکی از نشانویژگی‌های یاخته‌های گیاهی، توان بالقوه‌ی بزرگی در به دست آوردن نوترکیب‌های زادشناختی محسوب می‌گردد که با صرف زمان و دشواری‌های بسیاری با روش‌های به‌نژادی سنتی امکان‌پذیر نبوده است. اکنون کشت بافت گیاهی براساس چنین اصولی استوار گردیده و به سرعت در حال گسترش و ترقی می‌باشد.
رواج و کارآیی بالقوه‌ی روش‌های کشت بافت در اصلاح نژاد گیاهی عبارت است از:
(1) تکثیر گروهی،
(2) حذف عوامل بیماری‌زا،
(3) نگهداری ذخایرتوارثی به‌مدت زمان‌ طولانی،
(4) تولید گیاهان تک لاد (هاپلویید،
(5) ایجاد و انتخاب تغییرات زادشناختی،
(6) تولید محصولات ثانویه،
(7) انتقال ژن،
(8) دورگ‌گیری بین گونه‌‌‌ای و
(9) مهندسی زادشناختی مولکولی گیاهی.

جدول 1- روش‌های کشت بافت و کاربرد آن در تکثیر و اصلاح گیاهان

کشت پینه :
پینه زایی یک مرحله‌ی بسیار مهمی از کشت بافت را تشکیل می‌دهد و تولید پینه‌های رویان زا که دارای قابلیت باززایی گیاهی باشند همواره با محدودیت هایی مواجه بوده‌است. از‌این گذشته در مطالعات پینه‌زایی دو عامل مهم زادمون و محیط ( غذا، نور و حرارت) بیش از همه مورد توجه قرارمی‌گیرد. زادمون‌های یک گونه یا زیرگونه پاسخ‌های متفاوتی نسبت به کشت نشان می‌دهند. برای تولید پینه از کشت قطعات یک بافت نامتمایز یا کاملاً تمایز یافته و تبدیل آن به یک توده یاخته‌ای تمایز نیافته با ساختاری بی‌سازمان در محیط ‌های غذایی مصنوعی نیمه جامدی که محتوی همه‌ی مواد غذایی پرمصرف، کم مصرف و ساکارز به اضافه‌ی ترکیبات تنظیم کننده رشد به ویژه 2.4-D ، IAA ، NAA کینیتین و یک ژل نیمه جامد کننده باشد، استفاده می‌شود. قسمت‌هایی از گیاه که می‌تواند کشت شود شامل قطعات ساقه، ریشه. میان برگ(مزوفیل)، لپه، نوک شاخه، بافت گل، کامبیوم آوندی، فلس‌های پیازی، درون دانه، محور رویان، اشعه‌مرکزی، پارانشیم آوندی، سپرچه، محور زیرلپه، بساک، ریزهاگ و تخمک یا تخمدان می باشد. اگرچه اندازه، شکل، منابع گیاهی یا زادمون گیاه و شیوه‌ی کشت در القای تشکیل پینه تأثیر بسزایی دارد اما هر نوع قطعه‌ی زیر کشتی در شرایط محیط غذایی با ترکیبات ویژه ای و دوره نوری خاصی به کشت پاسخ می‌دهد. دانشمندان سی سال پس از شناسایی ترکیب 2 ,4-D به خواص هورمونی آن پی بردند و از آن در تمایز زدایی و تولید پینه استفاده کردند. در حال حاضر استفاده از این هورمون در پینه ز‌ایی به طور وسیعی رواج یافته است. در اغلب گیاهان و قطعات زیرکشت، القای پینه‌ در 25 درجه سانتی‌گراد و در تاریکی انجام می‌شود. پینه زایی از نشانویژگی‌های وراثتی محسوب می‌گردد. علاوه بر این عوامل تنکار شناختی ،منابع گیاهی ، محیطی و تیمارسرمایی پیش از کشت به ویژه در کشت‌های مربوط به بساک و ریزهاگ و تخمک اهمیت زیادی دارد.
کشت باززایی :
یاخته‌های پینه به منظور شاخه زایی و تولید گیاه کامل به محیط‌های غذایی دیگری که از نظر ترکیبات به ویژه میزان و نوع هورمون‌ها با محیط‌های غذایی پینه‌زایی متفاوتند، در شرایط گندزدایی شده انتقال می‌یابند.

با تغییر نسبت‌ تنظیم کنندگان رشدی می‌توان برای هر منبع گیاهی، محیط غذایی باززایی مناسبی که بیشترین بازدهی کشت را داشته باشد، تهیه کرد. در تمایزیابی پینه‌ها و به وجود آمدن اندام‌های نو پدید برای هر زاد مونی دوره‌ی نوری و درجه حرارت معینی پیشنهاد شده است. همه‌ی پینه‌ها برای تبدیل شدن به گیاه کامل مناسب نیستند و فقط پینه‌های رویان‌زا که اغلب دانه‌ای شکل، مدور، خشک و زرد کمرنگ هستند، بهتر پاسخ می‌دهند. پینه‌های رویان‌زا پس از عمل تمایزیابی ،اندام‌های اولیه‌ای را به وجود می‌آورند که سپس به شاخه‌ها، ریشه‌ها، گل‌ها، جوانه‌ها و رویان‌ها تبدیل می‌گردند. در غلات محدودیت‌هایی از نظر باززایی گیاهان زال مشاهده می‌شود که گاهی 90 تا 95 درصد تولید گیاه را دربر دارد و برای جلوگیری از این پدیده نامناسب، تحقیقاتی در حال انجام است. باززایی پینه‌از مسائل بسیار پیچیده کشت بافت بوده که در تعداد زیادی از گیاهان، بدون حل باقی مانده است. متأسفانه تعداد زیادی از پینه های گونه ها و همجوشی بین گونه‌ای گیاهان به باززایی پاسخ نمی دهند.
کشت بساک و ریزهاگ :
فنون کشت بساک و ریزهاگ به عنوان یک ابزار اصلاحی کارآمد و صرفه‌جویانه ای در تولید خط‌های جور تخم (هوموزیگوت) گیاهی در مدت زمان کوتاه در به‌نژادی مورد استفاده قرار می‌گیرد. گرده‌ی نارس یا ریزهاگ موجود در بساک در کشت‌های یک مرحله‌ای مستقیماً تولیدگیاه را می‌نماید و در حالت دو مرحله‌ای ابتدا پینه را تولید می‌کند و سپس در شرایط غذایی دیگری با نسبت هورمونی متفاوتی به گیاه باززایی می شود. ریزهاگ‌های داخل بساک تک لادند و نیمی از کروموزوم‌های بدنی را در اختیاردارند. هنگامی که در فرایند کشت بساک به یاخته‌های پینه و سپس به گیاه کامل تبدیل می‌گردند، یاخته‌های بدنی آن‌ها، تماماً تک لاد و در نتیجه گیاه تک لاد خواهد بود و از آن جا که این گیاهان نمی‌توانند تقسیم میوز را انجام دهند، از طریق بذر قابل تکثیر نیستند (در مواردی که پینه‌ها از دیواره بساک به وجود آمده باشند و یا به طورخود به خودی دولاد شده باشند و تولید بذر نمایند، بارورند). بنابراین، این گیاهان بایستی تحت اثر ماده شیمیایی کولشی سین به گیاهان دولاد تبدیل گردند که در آن کروموزوم‌ها به صورت جفت‌های مشابه وجود خواهند داشت و تک لادهای دو برابر یا دولادهای نرزاد (گیاهان گرده‌ای) جور تخم و خالصند و در خط‌های زادگیری (breeding) به منظور بروز صفات زاد شناختی مغلوب ساده یا جهش یافته مورد استفاده قرار می‌گیرند. برتری این روش در مقایسه با دورگ‌گیری سنتی عبارت است از :
1-کاهش مدت زمان لازم به‌نژادی با تثبیت جور تخمی
2- افزایش بازدهی انتخاب به دلیل احتمال بروز سریع ژن‌های مغلوب و پایداری ژن‌های نوترکیب بیشتر
3- تغییر پذیری وسیع زاد شناختی از راه تولید گوناگونی های گامتوکلنی
4- حل مشکل عقیمی در تلاقی‌های دور.
تاکنون کشت بساک بیش از دویست گونه گیاهی شامل غلات (جو، ذرت، چاودار، تری‌تیکال، گندم و غیره)، درختان میوه (سیب ،گلابی، گیلاس،مرکبات وبه)، درختان جنگلی (صنوبر و اوکالیپتوس)، سبزیجات (کلم، هویج، خیار، ترب، بادمجان)، گیاهان زراعی (چغندر و توتون) وگیاهان دارویی نیز به کشت بساک پاسخ داده‌اند. تاتوره اولین گیاهی بود که کشت بساک آن انجام شد

. بازدهی کشت بساک به طور وسیعی به زادمون و ساختار زادشناختی گیاه مادری و محیط کشت و شرایط نوری و درجه حرارت اتاق بستگی دارد. در کشت بساک غلات مدت زمان و درجه حرارت دوره سرما دهی و غلظت هورمونی محیط غذایی کشت در میزان تولید گیاهان سبز تأثیر می‌گذارد. از مطالعه باززایی پینه‌های حاصل از نسل اول دورگ‌ها می‌توان چنین استنباط کرد که قابلیت باززایی یک نشانویژگی وراثتی است و توسط ژن‌هایی هدایت می‌شود. از این گذشته در پینه‌هایی که به منظور انتقال ژن با ذرات طلای آغشته به DNA خارجی بمباران می‌شوند و پینه‌هایی که از پیش‌دش‌های امتزاج یافته حاصل می‌گردند، باززایی به سختی انجام می‌شود. پینه‌زایی و باززایی از مباحث اصلی پیشرفت و ترقی این علم محسوب می‌گردد