چکیده:
کفال ماهیان دریای خزر یکی از مهمترین ماهیان شیلاتی این دریا می باشند که امروزه اکثریت صید ماهیان دریای مذکور به خود اختصاص داده اند.: هدف از این تحقیق بررسی میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی[1] در شرایط زمانی، دمایی و تداوم بخش[2]های مختلف بوده است.: بدین منظور میزان ATP اسپرم های:
1) نمونه های تازه در دماهای مختلف 10-12 درجه و 18-20 درجه سانتی گراد،
2) نمونه های نگهداری شده در دماهای مختلف4 (درجه و دمای اتاق) به مدت شش ساعت،
3) نمونه های نگهداری شده در ( تداوم بخش های مختلف ( گلیسرول، محلول نمک 7/0 %، محلول نمک 65/0%) به مدت 5 و 10 روز، به روش فوق حساس بیو- لومینوسانس اندازه گیری گردید.
بر اساس آزمایش های انجام شده در این تحقیق غلظت ATP اسپرم های تازه نمونه گیری شده در دمای 10 تا 12 درجه سانتیگراد 22/7 ±04/74% غلظت ATP اسپرم های تازه نمونه گیری شده در دمای 18 تا 20 درجه بود. اسپرم های نگهداری شده در دمای 4 درجه و دمای آزمایشگاه به مدت 6 ساعت به ترتیب 91/0 ±26/90% و 49/1 ±17/17% ATP خود را حفظ کردند.
نگهداری اسپرم در تداوم بخش های مختلف( گلیسرول، محلول نمک 7/0 %، محلول نمک 65/0% ) به مدت 5 روز نشان داد که گلیسرول و محلول نمک 65/0% درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک 7/0% حفظ کردند و نگهداری اسپرم در همان تداوم بخش ها به مدت 10 روز نشان داد که گلیسرول درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک 7/0% و 65/0% حفظ کرد.
براساس نتایج بدست آمده برای حفظ میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی نمونه گیری در دمای 18-20 درجه و نگهداری در گلیسرول توصیه می شود.
واژگان کلیدی: اسپرم، ماهی کفال طلایی، ATP،
مقدمه:
اسپرم به عنوان یک عامل مهم تولید مثل، بقاء و تداوم نسل است. بررسی اسپرم از نظر پارامترهایی چون توانایی تلقیح، تحرک، درصد اسپرم های متحرک، سرعت حرکت، فرکانس ضربه تاژکی، میزان ATP و فاکتورهای شیمیایی و بیو شیمیایی، در تشخیص کیفیت اسپرم و کنترل روند تولید مثلی موجودات زنده از جمله آبزیان به ما کمک می کند. به همین علت تاکنون تحقیقات گسترده ایی توسط پژوهشگران مختلف روی این سلول صورت گرفته است. با این حال مطالعات انجام شده در ارتباط با میزان ATP اسپرم ماهیان نسبتا کم است. این امر تفسیر علت ناموفق بودن پروژه های پرورشی کردن برخی ماهیان را دشوار می کند. در این رابطه باید مطالعات بیشتری در زمینه بررسی میزان ATP اسپرم ماهیان صورت پذیرد. اسپرم به کمک حرکت ضربه ایی تاژک خود شنا می کند. انرژی مورد نیاز برای این حرکت از طریق هیدرولیزATP فراهم می شود.(1).تحرک اسپرم به میزان ATP ذخیره ایی اولیه(2) و میزان ATP سنتز شده در طول فاز تحرک (3) وابسته است. در اکثر ماهیانی که دارای لقاح خارجی هستند،ATP سنتاز قادر به نگهداری نسبت های بالای ATP هیدرولیز شده مورد نیاز در طول حرکت نیست لذا میزان ATP به سرعت کاهش می یابد. این کاهش ATP به موازات کاهش تعداد ضربات تاژکی و سرعت حرکت اسپرم است(2). یک رابطه خطی بین ظرفیت تلقیح اسپرم و پارامترهای اسپرمی از جمله میزان ATP و سرعت حرکت اسپرم وجود دارد(4) آنزیم اصلی تبدیل انرژی شیمیایی گرادیان پروتون در سیستم بیولوژیکی ، ATP سنتتاز است. این آنزیم برای سنتز ATP از ADP و فسفات غیرآلی استفاده می کند ساختمان و عملکرد این آنزیم در گونه های مختلف یکسان است (5) تفاوت قابل توجهی بین گونه ها در مقدار ATPمورد نیاز برای تامین حرکت اسپرم وجود دارد(6). تحقیقی در رابطه با میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی تاکنون صورت نگرفته است. در این پروژه سعی بر آن داشتیم که میزانATP اسپرم ماهی کفال طلایی را در شرایط مختلف اندازه گیری نماییم.
مواد و روشها:
به منظور بیان میزان ATP برحسب تعداد سلول ، تعداد اسپرم های موجود در یک میلی لیتر از مایع اسپرم اخذ شده از 10 ماهی نر کفال طلایی ، به کمک لام نئوبار و میکروسکوپ نوری (NIKON Y100) مورد شمارش قرار گرفت. در این تحقیق جهت بررسی تاثیر دمای نمونه گیری و میزان ATP اسپرم ماهی ، نمونه گیری در دو دمای ◦C 10-12 و18-20 ◦C انجام شد . ما در این تحقیق برای اندازه گیری میزان ATP از روش بیولومینوسانس استفاده کردیم بدین شکل که نمونه اسپرم را به نسبت 100/1 در محلول بافر HEPES جوشان مخلوط کرده سپس 50 از آن را با 50 از محلول کیت حساس بیولومینو سانس (Biaffin) در پلیت مخصوص اندازه گیری لومینوسانس با هم مخلوط کرده و سینگالهای لومینوسانس را با استفاده از دستگاه لومینومتر
10-19 mol/well, Germany) × (Lumistar ,BMG labtech GmbH, 5اندازه گیری کرده و سپس میزان ATP هرنمونه را با استفاده از استانداردهای ATP محاسبه کرده و بصورت nmol/108 اسپرم بیان کردیم.
درجه حرارت نگهداری اسپرم ها بر میزان ATP سلول های مذکور تاثیرگذار خواهد بود. لذا جهت بررسی دمای مناسب نگهداری ، اسپرم ها به مدت 6 ساعت در دمای 4 درجه و دمای آزمایشگاه نگهداری و سپس میزان ATP آن ها مورد اندازه گیری قرار گرفت. معمولا برای نگهداری اسپرم از محلول های تداوم بخشExtenders )) استفاده می کنند این محلول ها سبب تداوم و حفظ فعالیت اسپرم ها در دوره نگهداری می شوند. به منظور بررسی بهترین محلول تداوم بخش ، محلول گلیسرول 10 درصد و گلوکز 0.3 مولار ، محلول نمک 0.7 درصد و محلول نمک 0.65 درصد مورد بررسی قرار گرفتند . میزان ATP اسپرم ها در محلول های مذکور پس از نگهداری اسپرم در دمای منفی 15 درجه در زمان های 5 و 10 روز مورد سنجش قرار گرفت.
جهت انجام تحقیق در روز دهم آبان 1384از دریاچه خزر که دمای آب آن 18 تا 20◦C و شوری آن 12 تا 13 ppm بود و همچنین در روز 17 آبان 1384 در پی کولاک و کاهش چشمگیردمای هوا از دریاچه خزرکه دمای آب آن 10 تا 12 ◦C و شوری آن 12 تا ppm 13
بود تعدادی ماهی کفال طلایی صید کرده و پس از تعیین جنسیت، نمونه های نری را که هنوز اسپرم ریزی نکرده بودند انتخاب نموده و از بین آنها از 10 ماهی نر با طول تقریبی25 تا 30cm و وزن 900 تا 1100g نمونه گیری شد. بعد از نمونه گیری ، بلافاصله درب لوله های آزمایش توسط نوار پارافیلم محکم بسته شده و در جعبه یخ 4 ◦C به آزمایشگاه منتقل شدند. در واقع اسمولالیته پائین ادرار با تحریک اولیه موجب کاهش اولیه ذخیره ATP سلولی و کاهش کیفیت اسپرم کپور می شود. لذا ما برای ممانعت از کاهش کیفیت اسپرم، در طول نمونه گیری از آلوده شدن اسپرم به ادرار و هر گونه ماده آلوده کننده ای جلوگیری کردیم.
به منظور بررسی میزان ATP نمونه اسپرم نگهداری شده در شرایط آزمایشگاه و دمای 4 ◦C به مدت 6 ساعت، مقداری از نمونه اسپرم هر ماهی که در دمای 10 تا ◦C 12 نمونه گیری شده ، در شرایط آزمایشگاه (22 ◦C) و مقداری در دمای ◦C 4 نگهداری شد. همچنین به منظور بررسی میزان ATP نمونه اسپرم نگهداری شده در سرما در تداوم بخش های مختلف (محلول گلیسرول 10% و گلوکز 3/0 مولار، محلول نمک 7/0% ، محلول نمک 65/0% ) بعد از 5 و 10 روز ، یک حجم از اسپرم را با سه حجم از محلول تداوم بخش به آرامی مخلوط نموده و نمونه های اسپرم مخلوط شده با گلیسرول و محلول نمک 65/0% در دمای -15 ◦C و نمونه های مخلوط شده با محلول نمک 7/0% در دمای 1◦C بالای یخچال نگهداری شد.
Abstract:
Introduction: Caspian Sea Mugilidae is one of the most important fish of the sea fishery which nowadays is the predominant catches fish of the mentioned sea. ATP content of mentioned fish sperms is an important index of fish fertility.
Aim: Aim of this study was determination of sperm ATP content of Golden grey mullet in different time, temperature and extenders.
Materials & methods: Determination of samples ATP concentration was done by ultra sensitive bioluminescence method. ATP content of sperms were determined at two different sampling temperature(10-12 oC and 18-20 oC) and two different keeping temperature(4oC and room temperature) for six hours, and also ATP content assayed until 10 days storage at three extender types(Glycerol, 0.7 and 0.65% salt solution).
Results: This study results showed that, ATP content of sperms, collecting at 10-12oC was %74.04 ± 7.22, in comparison to 18-20oC. ATP content of Sperms during 6 hours keeping at 4oC and room temperature were %90.26± 0.91 and %17.17±1.49 respectively. Determination of Sperms ATP content after 5 days keeping on Glycerol, 0.65 and 0.7% salt solution revealed that Glycerol or 0.65% salt solution are better extender than 0.7% salt solution. But sperm keeping in mentioned extenders for 10 days showed that Glycerol was better than salt solutions in order to sperm ATP content saving.
Conclusion: Our results revealed that, in order to save sperms ATP content of Golden grey mullet, sampling at 18-20oC and keeping in Glycerol as extender is recommend.
Keywords: Sperm, ATP, golde