تحقیق مقاله پروتئین های مثوک حرارتی

)

پروتئین های مثوک حرارتی

همانطور که می دانید یک دسته از عواملی که در رشد و فعالیت میکروارگانیسم ها  موثر هستند عوامل محیطی می باشند که به 2 دسته فیزیکی و شیمیایی تقسیم می شوند. یکی از مهمترین این عوامل که به عنوان یک عامل فیزیکی مطرح می گردد گرما ( حرارت) می باشد. حرارت بر کلیه فعل و انفعالات سلولی اثر دارد و متابولیسم سلول را تحت تاثیر قرار می دهد. اگر حرارت تاحد معینی افزایش یابد واکنش ها را تسریع می کند ولی اگر از حد معین تجاز کند فعالیت های متابولیکی را متوقف می کند زیرا باعث می گردد که پروتئین ها ماهیت خود را از دست بدهند، دناتوره گردند، آنزیم های مهم و اساسی سلولی از کار افتاده روی غشا و فشار اسمزی اثر کرده در نتیجه نقل و انتقال مواد را تحت تاثیر قرارداده  و روی مواد غذایی کاهش می یابد و نفوذ مواد سمی و زاید افزایش پیدا کرده و خروج آنها کند می گردد. در نتیجه فعالیتهای سلولی مختل می گردد. همچنین دما روی فعالیت هایی مثل تولید اسپور، تولید پیگمان، عمل تخمیر و تنفس هم اثر می گذارد.

حرارت اپتیمم: مناسبترین درجه حرارت برای رشد یک باکتری را گویند.

حرارت لتال: حرارت کشنده باکتری ها که سبب می گردد تمام میکروارگانیسمهای یک گونه درعر 10 دقیقه کشته شوند.

ترموتولورانس : تحمل گرمایی

چاپرون ها :  مولکول هایی پروتئینی هستند که برای فولدینگ و تثبیت پروتئین ها اختصاص پیدا کرده اند و به پروتئین های جدید در حال ترجمه متصل می گردند.

Folding : تا شدگی پروتئین ها

Unfolding :باز شدن تای پروتئین

Refolding : تاخوردگی مجدد پروتیئن

باکتری ها از نظر نیازهای حرارتی به 3 دسته تقسیم می شوند:

ترموفیل ها یا گرما دوست ها با دمای opt بالای 45 درجه که در مناطق گرم، خاک و کود و ... زندگی می کنند و از نظر صنعتی نیز مهم هستند.

باکتریها هایپرترموفیل نیز گروهی از باکتری ها هستند که در حرارت بسیار بالا مثل مناطق آتشفشانی زندگی می کنند و قادر به رشدهستند و opt بالای 80دارند. مثل Bacillus steavo thermophilus

گروه دوم مزوفیل ها هستند مثل E coli که در حرارت های میانی رشد می کنند گروه سوم نیز ساکروفیل ها هستند مثل polaromonas که در حرارت های زیر 20 و حتی زیر صفر صفر رشد می کنند.

به طور کلی 2 پاسخی که سیستم های بیولوژیکی به حرارت می دهند شامل موارد زیر است:

1- fiuidity of the lipid bllayer

2- activity of enzyme systems

مورد اول و افزایش روانی غشای 2 لایه لیپیدی می تواند نهایتاً باعث تراوش یک سری از یون ها به خارج گردد که آرکیاها این مسئله را با داشتن یک سری اتصالات اتدی حل کرده و مقاوم شده اند.

مورد دوم فعالیت سیستم آنزیمی است که به ازای هر 10 درجه باعث 2 برابر شدن فعالیت می گردد که این دارای محدودیت است. اغلب ترموفیل ها آنزیمهایی دارند که دارای مقاومت حرارتی هستند از جمله با داشتن یکسری اتصالات و باندهای اضافه.

از جمله پاسخهای مهمی که ارگانیسم ها به تغییرات دمایی می دهند القا و تحریک تولید یک سری پروتئین ها می باشد که به 2 دسته تقسیم می گردند:

1- cold shock pro

2- Heat shock pro

Hsp ها 2 وظیفه کلی دارند که در شرایط فیزیولوژیکی به عنوان چایرون های مولکولی فعالیت می کنند و کاتالیز refoding پروتئین های دناتوره شده و کمک به بلوغ pro های تازه نستز شده و ممانعت از تراکم aggve pation پروتئیها.

دوم اینکه در پاسخ به استرسهای سلولی نقش دارند از جمله به طور عمده در برابر افزایش حرارت و به میزان کمتر از برابر فلزات سنگین، حضور رادیکالهای اکسیژن و اتانول و ... تولید می گردند. ( 2 و 3 و 4 )

بدست آوردن ترموتولورانس به افزایش بقا ارگانیسم ها در حرارت های کشنده برمی گردد وقتی که برای یک مدت زمان کوتاه در معرض حرارت های بالا و کشنده قرار بگیرند.

این پاسخ لازمه سنتز تعداد کمی از پروتئین ها است که بنام HSP ها شناخته        شده اند. تحقیقات بسیار زیادی برای بررسی این فرضیه انجام شده و نقش HSPها در مقاومت گرمایی مشخص گردید.

2 نتیجه کلی از این تحقیقات بدست می آید:

1- HSP ها حقیقتاً نقش مهم را در بدست آوردن مقاومت گرمایی بازی می کنند.

2- گونه های مختلف از استراتژی های مختلفی برای بدست آوردن مقاومت گرمایی استفاده می کنند ( با استفاده از HSPها  و دیگر ماکرومولکول ها)

اغلب تحقیقات انجام شده روی باکتری های ترموفیل فوکوس کرده اند و تعداد کمی نیز بر روی ترموفیل ها. ( 1)

HSP ها اولین بار  بعد از اینکه سلول ها به درجه حرارت های بالا عرضه گردیدند شناسایی شدند، در واقع به عنوان ترکیبات حیاتی از یک مکانیسم دفاعی سلولی بسیار حفاظت شده برای حفظ حیات سلول تحت شرایط محیطی شناخته شده اند.

این ها در پاسخ به عوامل یادشده در بالا همچنین فلزات سنگین و التهاب و عفونت ایجاد شده توسط پاتوژن ها بیان می گردند و در چند پروسه ضروری برای عملکردهای سلولی تحت شرایط فیزیولوژیکی دخالت دارند.

HSPها پروتئین هایی مربوط به استرس های سلولی بسیار محافظت شده اند که در هر ارگانیسم از باکتری ها تا انسان حضور دارند. اولین توضیح از یک پاسخ سلولی به فشار حرارت بیش از 37 سال پیش داده شد.

این اولین بار مشاهده شد در سال 1962 که کروموزومهای غدد بزاقی یک مگس سرکه  Drosophila meanogaster یک الگوی puf fing را بعد از قرار گرفتن در معرض حرارت نشان داد.

اولین محصول ژنی که در این پافینگ کروموزومی دخالت داشت 12 سال بعد شناسایی شد و heat shock protein نام گرفت.

از آن زمان به بعد بسیاری از تحریک کننده های دیگر که مسئول پاسخ شوک حرارتی بودند شناسایی شدند و مکان کروموزومی ژن های مربوط به این Pro ها نیز مشخص شدند. ژنها تعیین توالی شدند و کانفور فی شن pro های حاصل شرح داده شد و مکانیسم فعالیت ژن با فاکتورهای رونویسی شوک حرارتی مشخص گردید.

از آنجا که پاسخ شوک حرارتی یک مکانیسم حیاتی سلولی است، این قابل فهم است که HSP ها در رشته های پزشکی قابل توجه هستند.

تمام ارگانیسم ها با سوئیچ آف کردن سنتز تعداد زیادی pro ها و آغاز سنتز میزان زیادی از HSP ها به شوک ها پاسخ می دهند.

حتی ارگانیسم های ترموفیل که حرارت Opt رشدشان بین 50 تا 90 درجه میباشد نیز به افزایش ناگهانی حرارت با افزایش سریع بیان HSP  ها پاسخ می دهند.

ترکیب آمینو اسیدی HSPها در طول تکامل خیلی تغییر نکرده است و HSPهای بسیاری ارگانیسم ها بسیار شبیه یکدیگر است ( ساختمان آنها حفظ شده است).

برخی اعضای فایل  HSP با استرس القا شده در حالی که دیگر اعضا در حرارتهای نرمال هم بیان می شوند. ( 4 )

میکروارگانیسم های هایپر ترموفیل که می توانند در 100 درجه یا بالاتر رشد کنند اکنون به خوبی مطالعه شده اند اگرچه در رابطه با پاسخ های آداپتیو آنها در برابر حرارت های بسیار بالا میزان اطلاعات کمی وجود دارد.

HSP های برپایه وزن مولکولی شان به 5 Class تقسیم می گردند:

HSP های 60 و 70 و 90 و 100 و HSP Small ها.

HSP Small ها یا s HSPs یک کلاس متداول از HSP ها هستند و رنج وزن مولکولی آنها از 15 تا 45 KDa می باشد و آنها بطور نرمال از کمپلکسهای چند زیر واحدی ( مولتی ساب یونیت) از 200 تا 800 KDa تشکیل می شوند.

برخی از s SHP ها در حالت عادی در سلول های بدون استرس حضور دارند ولی سایرین با استرس القا می گردند.

اغلب s HSP ها به Pro های x- کریستالین که در لنزهای چشم یافت می شوند اشتراک فعالیت دارند و از نظر عملکردی نیز به عنوان چاپرون های مولکولی شناخته شده اند. ( 3)

القا HSP ها در ابتدا در پروکاریوت ها و هم در یوکاریوت ها در سط رونویسی تنظیم می گردد و در ارگانیسم های مختلف عملکردی مشابه دارند و در طول شوک حرارتی رونویسی از آنها با القای ژن های آنها افزایش می یابد در پروکاریوت ها پاسخ شوک حرارتی بعد از 10 دقیقه معمولاً خاموش می شود (2)

در اینجا پاسخ های شوک حرارتی و مکانیسم های تنظیمی و انواع HSP ها و HSP s های تولیدی در باکتری های مختلف شرح داده شده است از جمله:

1-  حصول ترموتولورانس در 3 دومین فیلوژنتیکی شامل 3 میکروارگانیسم:

Bacillus Caldly ticus  ،

Sulfo lobus shibatae  ،

Thermomyces lanuginosus از 3 حوزه  (Bacteria , Archaea , Eucarya)

2- Borre lia Burydorferi

3- بدست آمدن ترموتولورانس و شوک حرارتی در آرکیاباکتری اکستریم ترموفیل sulfo lobus sp. Stran B12

4- مکانیسم و عملکرد HSP sها درآریکای هایپرترموفیل pyrococus furiosus

5- باکتری ترمواسیدوفیل آرکیایی sulfolobus tokodaii strain 7

6- باکتری مزوفیل Ecoli بطور کامل و دقیق

7- باکتری Bacillus subtilis

عنوان

* بررسی حصول ترموتولورانس و HSP ها در ترموفیل ها از 3 حوزه

فیلوژنتیکی:

ارگانیسم های ترموفیل از هر 3 حوزه ژنتیکی باکتری ها و آرکیاها و یوکاریوتها بعد از شوک حرارتی مقاومت گرمایی بدست آورده اند.

Bacillus caldoly ticus در 60 درجه رشد داده شد و در 69 درجه برای 10دقیقه شوک گرمایی داده شد و مقاومت گرمایی تا 74 درجه نشان داد.

Sulfolobus shibatae در 70 درجه رشد داده شد و شوک حرارتی در 88 درجه برای 60 دقیقه، مقاومت گرمایی تا 95 درجه نشان داد.

Thermomyces ;amigompsus  در 50 درجه رشد داده شد و شوک حرارتی در 55 درجه برای 60 دقیقه مقاومت گرمایی تا 85 درجه را نشان داد. تعیین سنتز pro در طول شوک حرارتی اختلاف در HSP های عمده برای هرگونه را آشکار کرد.

برای B.caldoly ticus یک پروتئین  kda  70 غالب است در حالی که s.shibatae یک KDa pro 55 و برای T .lanuginosos pro های 31 تا 32 KDa غالب هستند.

همچنین معرف هایی که سنتز pro های نرمال را در طول شوک حرارتی می شکند مانع افزایش مقاومت گرمایی شد. ( 1 )

* حصول ترموتولورانس :

روش مورد استفاده مشابه سایر پروسه های توضیح داده شده است، اساساً یکی از 2 نمونه یکسان از یک کشت در حال رشد فعال شوک حرارتی داده شد در حالی که دیگری در حرارت معمول و آغازین رشد نگهداری می گردد.

در پایان دوره شوک هر 2 نمونه به یک حرارت کشنده انتقال داده شدند و بقای آنها بصورت تابعی از زمان نشان داده شد.

نمونه های باسیلوس در 60 درجه رشد داده شدند با شیک شدید در محیط مایع BC محتوی 5/0 درصد کلوکز و 2/0 % گاز امینواسید و NH4CL

و در 69 درجه برای 10 دقیقه شوک داده شدند و در یک حرارت کشنده 74 درجه قرار داده شدند. سلول های زنده در محیط BC شمارش شدند دارای آگار و عصاره مخمر و تریپتون با یک شب انکوبه شدن در 60 درجه .

- نمونه های سولفولوبوس در 70 درجه رشد داده شدند با تکان ملایم در محیط مایع SS محتوی دکسترین و برای 60 دقیقه در 88 درجه شوک داده شده و در معرض 95 درجه قرار گرفتند و سلولهای زنده با تهیه رفت هایی از محیط SSشمارش شدند.

- سرانجام نمونه هایی از Conidia  از ترموماسیس برای 4 ساعت در 50 درجه انکو به شدند با شیک در یک محیط YPS تغییر یافته ( محیط  T1 ) که بالای 90درصد آنها رشد کردد. در 55 درجه برای 60 دقیقه شوک داده شدند و در 58 درجه منتقل گردیدند و Conidia های زنده شمارش شدند با شمارش کلنی های میسلیوم که روی محیط T1 جامد و سخت شده با 2 درصد آگار بعد از 48 ساعت در 45 درجه از دقت ها رشد کردند.

- تحت شرایط آزمایش ها تمام 3 گونه ترموفیل ترموتولورانس را بدست آوردند اگرچه زمان پاسخ آنها ومیزان تحمل آن ها متفاوت است ( شکل 1)

اختلاف در حیات سلول ها با شوک حرارتی و بدون شوک به قدرکافی زیاد بود که علیرغم تفاوت بین آزمایش ها شکی وجود ندارد که برخی تطابق های مولکولی اتفاق افتاده است.

برای بررسی چگونگی وقوع این تطابق ها، تغییر در سنتز Pro در طول آزمایش ها نمایش داده شد.(1)

* سنتز پروتئین های شوک حرارتی و الکتروفورز ژن :

سنتز Pro در شرایط و حرارت های نرمال و حرارت های شوک با سلولهای pulse – labeling با methionine ‍[ S 35  ]- L تعیین گردید.

5 میلی متر نمونه از باسیلوس در فاز Log برای 5 دقیقه با 10 MC با میتونین در محیط BC نشان دار شدند با جایگزین کردن کارامینواسید با یک آمینواسید میتونین Free

یک میلی لیتر از نمونه سولفولوبوس در فاز log با 10 MC از میتونین نشاندار برای 15 دقیقه در محیط استاندارد.

5 میلی لیتر نمونه Conidia از ترموماسیز که در محلول نمک شسته شدند و با 100 MC از میتونین برای 10 دقیقه در محیط T1 نشاندار شدند.

در پایان زمان Labeling سلول های باسیلوس و سولفولوبوس با سانتریفیوژ حاصل شدند و در محیط کشت شسته شدند و در SDS لایز شدند. الکتروفور ژن SDS انجام شد و ژن با کوماسی بلو رنگ آمیزی گردید و آتورادیوگرافی آن انجام شد.

Conidia های labele شده از ترموماسیز توسط سانتریفیوژ جدا شده و در یک محلول نمکی با میتونین های unlabele شسته شدند و دوباره در 300 میلی لیتر از همان محلول حل شدند.

Conidia ها لایز شدند با تکرار سیکل هایی از freeze – thawing, sonication در 80 – درجه.

به دنبال آن با انجام سانتریفیوژ pro ها از مایع رویی رسوب داده شدند با 10درصد ice-cold از تری کلرو استیک اسید.

رسوب شسته شده توسط 5/0 ice- cold  ml استون ، در خلا خشک گردید و دوباره در 150 m1 از SDS gel Buffer برای الکتروفورز آماده شدند.

تمام نمونه ها تا 100 درجه برای 5 دقیقه مستقیماً حرارت داده شدند قبل از الکتروفورز بعد از الکتروفروز ژن رنگ آمیزی گردید با کوماس برلیانت بلو و برای اتو رادیوگرافی استفاده شد.

درهر 3 گونه ترموفیل شوک حرارتی بطور واضح الگوی سنتز pro ها را تغییر داد(شکل2)

این تغییر در الگوی pro ها شامل تغییر هم در تعداد pro ها و هم در شدت و درجه باندای visible بود.

در باسیلوس باندها با توده های مولکولی 19    39    54    60    و 67 و  78 kda بطور واضح از نظر شدت افزایش یافتند در حالی که شدت دیگر Pro ها کاهش یافت و در همان حد باقی ماند ( fig 2 A )، فقط رویت باند KDa 78   از نظر شدت کاهش یافت از دوره اول شوک ( 0 تا 5 دقیقه ) تا دوره دوم ( 5 تا 10 دقیقه ).

5 باند دیگر القا شده با حرارت نیز افزایش شدتشان را در طول هر 2 دوره شوک حفظ کردند ولی باند KDa 78 از نظر شدت روی ژل رنگ آمیزی شده با کوماسی برلیانت بلو شدتش افزایش یافت.

- در 2 گونه دیگر باسیلوس B.steavothermophilus , B.subtilis تقریباً 12  HSP شناسایی شدند و همان رنج از توده مولکولی را برای B. caldolyticus مشاهده کردیم.

در این باسیل ها HSP اصلی وزن مولکولی 70 KDa را دارد.

- در S.Shibatae یک باند اصلی از تقریباً 55 KDa و 5 باند minor                    از  27    32    49  65  و 82    KDa   مشاهده شدند ( شکل 2B )

این مشاهده مسلم گزارش کرد وجود یک Major   pro  55  KDa و 2 Minor 28، 35  KDa در این ارگانیسم.

3 باند دیگر القاشده با حرارت 49     65    و    82    KDa  نسبتاً خفیف نیز دیده شد.

ما متوجه شدیم که باند  55  KDa  بطور قابل توجهی هم در شرایط نرمال و هم حرارت غلبه دارد.

گزارشات ثابت کرد که این باند 4 تا 6 برابر در طول یک دوره شرکت حرارتی 86 تا 88 درجه از نظر شدت افزایش می یابد و pro منسوب به کلاس 60 HSP از چاپرون های مولکولی است.

در T. lannginosus کل 8 باند 31/32/33/57/65/78/100 و 110 KDa در طول اولین مرحله شوک شدتشان افزایش یافته در طول دوره دوم 31 و 32 و 33 kDa در شدت‌های افزایش‌ یافته در طول دوره دوم labeling (50 تا 40 min)باقی ماندند. (شکل c2)

تمام این باندها در محدوده مورد انتظار برایHSP های گزارش شده سایر قارچ‌ها هستند.

در دیگر قارچ‌های رشته‌ای MSP. Neurospora Crassa 70 و 80و90 بیشتر القا می‌شوند البته این به محیط رشد نیز بستگی دارد.

در T. lannginosus MSP های بزرگ فوراً القا می‌شدند پس از انتقال حرارتی اما گروه HSPهای Small بطور واضح در پاسخ شوک حرارتی در طول هر دوره labeling غلبه دارند.

سنتز HSPهای Small برای Dictyostelium discoideum و N.Crassa گزارش شده است. (1)

* ارتباط بین ترموتولورانس و سنتز pro :

اثرات بازدارنده‌های سنتز pro روی توسعه ترموتولورانس در طول شوک حرارتی در B.caldolyticns و S.shilatae در شکل fig3 نشان داده شده است.

برای B.caldolyticns ؟ (200 mg/ml200) سنتز pro را در طول شوک حرارتی ممانعت می‌کند و افزایش بقا در رابطه با ترموتولورانس را از بین می‌برد.

برای S.shilatae آمینواسید آنالوگ azitidine در یک غلظت 5.0 Mm به سنتز pro عملکردی در طول شوک حرارتی آسیب می‌زند و ترموتولورانس را از بین می‌برد.

آزمایشات کنترل که در آن‌ها این معرف‌ها بعد از شوک حرارتی یا حرارت‌های نرمال اضافه شدند نشان داد که هیچ یک سمی نبودند و اگر بعد از شوک اضافه گردند ترموتولورانس بدست آمده دوباره مشاهده می‌گردد.

در S.shilatae تحت شرایط آزمایش‌ها azetidine به طور آشکاری سرعت تشکیل متیونین هم در دماهای نرمال و هم شوک حرارتی را کاهش داد. این سنتز هیچ یک ازباندهای القا شده با حرارت توضیح داده شده در بالا را تحریک نکرد اگر چه به طور قابل ملاحظه‌ای تشکیل باندهای 53 و 60 kDa را در حرارت‌های نرمال افزایش می‌دهد و باعث می‌شود که باند اصلی القا شده با شوک حرارتی  (55 KDa) نمایان شود.